蔡霞，呂竹芬，陳燕忠（廣東藥學(xué)院/廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市510006）

微乳是一種外觀透明、液滴粒徑小于100 nm、熱力學(xué)穩(wěn)定的體系[1，2]。微乳作為藥物載體，還具有低黏度、吸收迅速、靶向釋藥的特點(diǎn)，并可提高藥物的生物利用度，降低毒副作用[3]，因此，近年來微乳在經(jīng)皮給藥方面逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

鹽酸氟西?。‵luoxetine hydrochloride，F(xiàn)LU），化學(xué)名為（±）-N-甲基-γ-[4-（三氟甲基）-苯氧基]-苯丙胺鹽酸鹽。分子量為345.8，熔點(diǎn)為155～158℃，易溶于乙醇和氯仿，微溶于水，乙醚中不溶。FLU是親脂類藥物，易透過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種神經(jīng)中樞5-羥色胺特異性重?cái)z取抑制劑，目前在臨床上是治療重度抑郁癥的首選藥物。但是FLU由于需要長期給藥，且有胃腸刺激副反應(yīng)，因此，患者依從性較差，易致維持治療失敗[4]。為克服此缺點(diǎn)，依據(jù)透皮給藥途徑對(duì)藥物的理化性質(zhì)要求[5]，可將其制成透皮給藥制劑，并具有使用舒適方便、劑量調(diào)整簡單的優(yōu)點(diǎn)?；诖?，本實(shí)驗(yàn)室制備了含F(xiàn)LU的O/W微乳，用改進(jìn)的Franz擴(kuò)散池對(duì)FLU微乳經(jīng)離體大鼠皮的透皮速率進(jìn)行了研究，評(píng)價(jià)了FLU微乳的透皮作用。

1 材料

Ultimate3000高效液相色譜儀（戴安公司）；TK-12B透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海凱鍇科技貿(mào)易有限公司）；Zetasize Nano-ZS90多功能電位/粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

FLU原料藥（上海華理生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：810001，含量：99.54%）；FLU對(duì)照品（澳大利亞Alphapharm Pty Ltd Company，批號(hào)：B0590ME，含量：99.7%）；FLU微乳（自制，規(guī)格：9.95 mg·mL－1）。

肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、油酸乙酯（EO）、油酸（OA）均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；聚乙二醇羥硬脂酸酯15（Solutol?SH15）、聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL35）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40）均由德國BASF Chemical Company提供；聚乙二醇400（PEG400，廣東汕頭市西隴化工廠）；三辛酸/癸酸甘油酯（GTCC，英國禾大公司）；四氫呋喃、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純。

Wistar大鼠，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，♂，體質(zhì)量（220±20）g。許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020，粵監(jiān)證字2008A003。

2 方法與結(jié)果

2.1 空白微乳處方組成的篩選

以Solutol?SH15、Cremophor RH40、Cremophor EL35、吐溫-80為表面活性劑，甘油、丙二醇、PEG400為助表面活性劑，EO、OA、GTTC、IPM為油相，根據(jù)三者不同的質(zhì)量配比，利用偽三元相圖初步篩選出表面活性劑、助表面活性劑、油相和表面活性劑/助表面活性劑的質(zhì)量比（Km值）。質(zhì)量配比見表1。

表1 表面活性劑/助表面活性劑與油相質(zhì)量配比Tab 1 The mass ratio of surfactant/cosurfactant to oil phase

分別將表面活性劑與助表面活性劑混勻后，室溫下攪拌10 min，再依次與油相按不同質(zhì)量比均勻混合，用蒸餾水滴定3種成分的混合物，觀察是否形成澄清透明的微乳，并繪制偽三元相圖。通過偽三元相圖確篩選出空白微乳處方的組成為IPM/Solutol?SH15/PEG400/水，Km為1∶1。

2.2 FLU微乳的制備

在室溫下將IPM、Solutol?SH15、PEG400按比例充分混合后，加入FLU原料藥，充分?jǐn)嚢?，使之溶解，然后在攪拌的條件下緩慢滴入處方量的水，即得透明的FLU微乳樣品。

2.3 微乳類型的鑒定

染色法：亞甲藍(lán)染料為水溶性溶液，易在水溶液中擴(kuò)散：蘇丹紅染料為油性染料，易在油相中擴(kuò)散。如果亞甲藍(lán)染料的擴(kuò)散速度大于蘇丹紅染料的擴(kuò)散速度，則為O/W型微乳；相反則為W/O型微乳。

取相同體積的空白微乳和FLU微乳，同時(shí)分別加入亞甲藍(lán)染料和蘇丹紅，靜止放置，結(jié)果，空白微乳和FLU微乳中水溶性亞甲藍(lán)染料的擴(kuò)散速度大于油溶性的蘇丹紅染料的擴(kuò)散速度，故確證制備的空白微乳和FLU微乳為O/W型微乳。

2.4 微乳的粒徑及分布

用粒度分析儀測(cè)得微乳的平均粒徑為44.6 nm，呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)為0.317，詳見圖1。

圖1 微乳粒度正態(tài)分布圖Fig 1 Normal distribution of particle diameter

2.5 微乳的離心試驗(yàn)

通過離心試驗(yàn)評(píng)價(jià)微乳的物理穩(wěn)定性。取適量FLU微乳置于離心試管中，以10 000 r·min－1的速度離心15 min，觀察微乳的外觀和沉降情況。結(jié)果表明，微乳澄清透明，不分層，不沉降，符合微乳穩(wěn)定性的要求。

2.6 含量測(cè)定方法的建立

2.6.1 色譜條件。色譜柱：Kromasil 100-5 C8（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相：1.0%三乙胺（用磷酸調(diào)pH值為6.0）-四氫呋喃-甲醇（40∶40∶20）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長：227 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。在此色譜條件下，取“2.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液及“2.8”項(xiàng)下空白皮膚接收液、供試品接收液進(jìn)樣分析，結(jié)果，輔料及皮膚內(nèi)源性物質(zhì)不干擾FLU的測(cè)定，色譜詳見圖2。

2.6.2 線性關(guān)系。精密稱取FLU對(duì)照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，以甲醇溶解，得濃度為100μg·mL－1的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成濃度為10、25、50、75、100 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.704 9C－0.844 8（r＝0.999 7），表明FLU檢測(cè)濃度線性范圍為10～100 μg·mL－1。

2.6.3 回收率試驗(yàn)。制備低、中、高3個(gè)濃度（相當(dāng)于200、250、300μg·mL－1）的對(duì)照品溶液，精密移取上述溶液與空白微乳各1 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加適量甲醇溶液超聲20 min，定容，過濾，精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄結(jié)果分別計(jì)算。結(jié)果，低、中、高濃度的樣品回收率分別為100.6%、106%、102.8%，RSD分別為1.89%、1.02%、1.73%。

2.6.4 精密度試驗(yàn)。取濃度為40、50、60 μg·mL－1的FLU對(duì)照品溶液，分別于與同日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)6 d重復(fù)進(jìn)樣6次，考察日間精密度。結(jié)果表明，低、中、高3個(gè)濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于2%，表明精密度符合方法學(xué)要求。

圖2 高效液相色譜圖1.空白皮膚接收液；2.對(duì)照品；3.供試品接收液；a.溶劑；b.FLUFig 2 HPLC chromatograms1.blank skin receiving solution；2.reference substance；3.test receiving solution；a.solvent；b.fluxetine hydrochloride

2.7 微乳初步穩(wěn)定性考察

將FLU微乳密封后在室溫條件下（相對(duì)濕度為75%）放置，于0、2、4個(gè)月取樣觀察，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果，微乳在室溫條件下放置外觀澄清透明，無沉淀析出，離心后也未見分層，含量分別為100%、99.7%、99.5%，無明顯降低。

2.8 透皮試驗(yàn)

2.8.1 離體鼠皮的制備。將大鼠處死，用脫毛劑脫毛，剝離腹部皮膚，在玻璃板上小心刮去皮下脂肪和粘連物，用蒸餾水和生理鹽水沖洗干凈，冷凍保存，待用。

2.8.2 透皮方法。將大鼠腹部皮膚固定在Franz擴(kuò)散池的2個(gè)半池之間，角質(zhì)層面向供給池，有效滲透面積2.92 cm2，接受液體積為7 mL，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為250 r·min－1。接收液為0.02%疊氮化鈉生理鹽水。取1 mL FLU（9.95 mg·mL－1）微乳適量均勻涂布于皮膚表面，分別于1、2、4、6、8、10、12 h取樣1 mL（同時(shí)補(bǔ)充等量同溫接收液），樣品適量稀釋，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算單位面積累積透皮量（Q）和穩(wěn)態(tài)透皮速率（J）。

用公式Qn＝CnV/A計(jì)算藥物累積透皮量，其中Qn為t時(shí)間單位面積累積透皮量，Cn為t時(shí)間藥物的濃度，V為接受液總體積，A為有效擴(kuò)散面積，以Qn對(duì)t采用Higuchi方程擬合，所得直線斜率即為平均透皮速率Jss（μg·cm－2·h－1）。

2.8.3 油相含量對(duì)FLU透皮吸收的影響。以IPM占體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、7%、11%、20%、25%制備FLU微乳液，進(jìn)行體外透皮試驗(yàn)，考察不同油相含量對(duì)FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖3。

圖3 油相含量對(duì)FLU透皮吸收的影響Fig 3 Effect of the content of oil phase on the percutanous penetration of FLU

從圖3可見，在藥物濃度相同情況下，當(dāng)體系中IPM含量為4%時(shí)，12 h內(nèi)無藥物透過（故在圖3中無此曲線）；當(dāng)IPM含量由7%增大到11%時(shí)，J值和Q值驟然增加；當(dāng)IPM含量為11%時(shí)J和Q值均達(dá)到最大值，隨后二者均隨含量增大而降低?？梢奍PM雖然是一種有效的透皮吸收促進(jìn)劑，其促進(jìn)效果并不隨含量增大而線性增加，存在最佳濃度值，當(dāng)其濃度超過該值時(shí)，透皮吸收促進(jìn)效果反而下降。

2.8.4 混合表面活性劑含量對(duì)FLU透皮吸收的影響。當(dāng)油相的量固定為11%，混合表面活性劑的總量（Smix，即表面活性劑Solutol?SH15和助表面活性劑PEG400質(zhì)量之和）分別為35%、43%、48%、52%、55%時(shí)，考察不同Smix對(duì)FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖4。

圖4 混合表面活性劑含量對(duì)FLU透皮吸收的影響Fig 4 Effect of the content of mixed surfactants on the percutanous penetration of FLU

由圖4可見，隨著Smix的增加，藥物的J值先增大后減??；當(dāng)Smix為43%時(shí)，J和Q值均達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)檫B續(xù)相中藥物的濃度決定藥物透皮吸收，表面活性劑的濃度過高會(huì)使連續(xù)相中分子存在的藥物濃度降低，導(dǎo)致藥物的擴(kuò)散速度下降，從而使藥物在皮膚的滯留量下降[6]。

2.8.5 載藥量對(duì)FLU透皮吸收的影響。制備含F(xiàn)LU分別為0.5%、0.7%、1%、2%、4%（W/W）的微乳液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行離體大鼠皮膚體外透皮試驗(yàn)?？疾觳煌d藥量對(duì)FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖5。

圖5所示，微乳的載藥量由0.5%增加到1%時(shí)，J值明顯增加（P＜0.05）；而當(dāng)載藥量增加至2%時(shí)，J值則下降。這表明皮膚的吸收過程存在“飽和”現(xiàn)象，隨著體系載藥量的增加，藥物與載體的親和力可能亦相應(yīng)增加，從而使藥物的熱力學(xué)活性降低，J值下降。

對(duì)以上結(jié)果綜合分析，得到微乳經(jīng)皮滲透的處方為FLU/IPM/Solutol?SH15/PEG400/水（1∶9∶20∶20∶39）。

圖5 載藥量對(duì)FLU透皮吸收的影響Fig 5 Effect of drug-loading amount on the percutanous penetration of FLU

2.8.6 處方驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)以上結(jié)果，即以油相含量為11%、混合表面活性劑含量為43%、載藥量為1%，制備3批FLU微乳。以Q對(duì)t采用Higuchi方程擬合，得3批樣品的平均J值為（128.96±0.32）μg·cm－2·h－1，詳見表2。

表2 3批FLU微乳的透皮試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Permeation parameters of 3 batches of FLU microemulsion

3 討論

油相、表面活性劑及助表面活性劑是形成微乳所必需的組分，但由于種類繁多，本文利用偽三元相圖進(jìn)行處方篩選，得到空白微乳的處方組成為IPM/Solutol?SH15/PEG400/水。

微乳透皮性能高低與油相的種類、含量直接相關(guān)，研究表明IPM既可作為微乳的油相，又可以增加角質(zhì)間的脂質(zhì)流動(dòng)性，使藥物更易透過角質(zhì)層，具有強(qiáng)大的促透效果[7]；表面活性劑可能是通過改變角質(zhì)層、膽甾醇和類脂的結(jié)構(gòu)甚至移除從而起到促進(jìn)透皮吸收的作用；助表面活性劑可插入到表面活性劑的界面膜中，形成復(fù)合凝聚膜，提高膜的牢固性和柔順性，又可大大增加表面活性劑的溶解度，同時(shí)形成更小的乳滴，并增加納米乳的透皮性；微乳中藥物的溶解量也會(huì)影響載藥系統(tǒng)的透皮吸收能力。

[1]Aviram S，Abraham A.Microemulsions as carries for drugs and nutraceuticals[J].Advance in Colloid and Interface Science，2006，21（5）：47.

[2]王曉黎，蔣雪濤.微乳在藥劑學(xué)上的應(yīng)用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，16（2）：88.

[3]張立超，胡晉紅.微乳透皮給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)-藥學(xué)分冊(cè)，2004，31（1）：44.

[4]胡岱麗，王洪建，張翠蓮.氟西汀的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2008，6（1）：54.

[5]狄平平，徐 遠(yuǎn)，張 圩.鹽酸氟西汀化學(xué)結(jié)構(gòu)確證及其理化性質(zhì)的研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，27（7）：317.

[6]Changz M，Varshney M.Aerosol OT microemulsions as transdermal carries of tetracaine hydrochloride[J].Drug Dev Ind Pharm，2000，26（5）：507.

[7]趙永哲，劉繼勇，胡晉紅，等.苦參堿微乳的制備及透皮研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8（4）：252.