呂品田，檀碧波，劉 斌，韓 杰#

1)河北省人民醫(yī)院腫瘤科石家莊050051 2)河北省人民醫(yī)院胃腸外科石家莊050051

順鉑(cisplatin，DDP)作為胃癌化療的常用一線藥物，在胃癌綜合治療中起重要作用，但腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)現(xiàn)象的存在嚴重影響了其化療效果，了解DDP化療藥敏性與耐藥相關(guān)因子表達的關(guān)系對預測化療療效有重要意義。胃癌轉(zhuǎn)移灶MDR與原發(fā)灶相比具有異質(zhì)性，進展期胃癌切除術(shù)后化療的目標應(yīng)針對轉(zhuǎn)移灶和(或)殘留病灶［1-3］，而關(guān)于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶 DDP藥敏性與MDR相關(guān)因子表達關(guān)系的研究尚未見報道。由于胃癌MDR涉及多種機制及耐藥相關(guān)基因/蛋白，故作者對胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶DDP體外化療藥敏性與多種MDR相關(guān)因子表達進行多因素分析，以篩選與DDP耐藥性關(guān)系密切的耐藥因子。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2006年10月至2008年5月在河北省人民醫(yī)院手術(shù)并經(jīng)病理證實伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者54例，其中男32例，女22例，年齡36.0～80.0(62.6±15.8)歲。所有病例術(shù)前均未接受放、化療。

1.2 腫瘤細胞的培養(yǎng)及化療藥敏性實驗 術(shù)中標本離體后分別取新鮮腫瘤組織、相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1～2 枚(均1.0 cm × 0.5 cm ×0.5 cm)置入雙抗(青霉素G鈉100 kU/L、鏈霉素200 mg/L)培養(yǎng)液，2 h內(nèi)行原代細胞培養(yǎng)化療藥物敏感實驗。分別將腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織經(jīng)研磨分散，用細胞分離器調(diào)細胞密度為5×105mL－1。培養(yǎng)前將腫瘤藥敏檢測板和DMEM培養(yǎng)基預溫至37℃。化療藥物DDP為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品(10 mg/支)，藥物終質(zhì)量濃度為血漿峰值濃度(4.0 mg/L)［4］。以不加藥物的細胞為對照。設(shè)3個復孔，接種細胞懸液200 μL/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加噻唑藍(MTT，5 g/L)20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 3 ～24 h，1 000 r/min離心10 min，棄上清，吸水紙吸去殘留液體，加入DMSO 100 μL/孔，輕輕振蕩混勻，酶標儀570 nm測各孔吸光度(A)，計算腫瘤細胞生長抑制率(IR)。IR=(1－給藥孔A/對照A)×100%。

1.3 腫瘤原發(fā)灶、相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P-gp、GST-π、P53、Survivin、Bcl-2和 Bax蛋白表達的免疫組織化學測定 鼠抗人 P-gp、GST-π、P53、Survivin、Bcl-2及Bax單克隆抗體和免疫組織化學染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(美國Zymed公司產(chǎn)品)，采用SP法分別對腫瘤原發(fā)灶、相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進行上述指標的免疫組織化學染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。由2位病理醫(yī)師分別雙盲閱片進行結(jié)果判斷。每張切片取5個高倍視野，每視野計數(shù)100個細胞，P-gp、GST-π、Survivin、Bcl-2及Bax以胞膜和(或)胞質(zhì)、P53以胞核著黃色為陽性，按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行計分。著色強度計分:無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分;陽性細胞率計分:陽性細胞≤5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，＞75%為4分。2項分值的乘積為0或1分表示陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(?)，≥7分為強陽性(?)。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SAS 8.0分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用配對t檢驗，等級資料采用Wilcoxon配對秩和檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，以CDDP對腫瘤細胞的藥物抑制率為因變量(^y)、多種耐藥相關(guān)因子的表達強度為自變量(P-gp為X1，GST-π為 X2，P53 為 X3，Survivin 為 X4，Bcl-2 為 X5，Bax為X6)建立多重線性回歸模型，分析胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間DDP抑制率與耐藥相關(guān)因子表達的關(guān)系。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DDP對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、原發(fā)灶腫瘤細胞抑制率的比較 DDP對原發(fā)灶中胃癌細胞的IR為(27.04±8.37)%，對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胃癌細胞的IR為(26.10±10.03)%，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.530，P=0.597)。

2.2 胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間DDP抑制率與耐藥相關(guān)因子表達的關(guān)系 原發(fā)灶中藥物抑制率僅與GST-π 有關(guān)，回歸方程為^y=33.894 16 －2.937 X2，GST-π表達水平越高藥物抑制率越低(β=－2.937，P=0.010)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中藥物抑制率與P53、Survivin、Bcl-2表達有線性回歸關(guān)系，所得回歸方程為:^y=34.06+2.013X3－2.652X4－3.466X5;P53表達水平越高藥物抑制率越高(β=2.015，P=0.026)，而Survivin、Bcl-2表達水平越高藥物抑制率也越低(β = －2.652，－3.466，P 分別為 0.046 和0.002)。

2.3 胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間耐藥相關(guān)因子表達強度 見圖1、表1。

圖1 胃癌原發(fā)灶(A)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(B)中耐藥相關(guān)因子的表達(SP，×400)

表1 胃癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中耐藥相關(guān)因子的表達情況

3 討論

DDP為胃癌化療的一線抗癌藥物，主要靶分子是腫瘤細胞的DNA，該藥通過與DNA結(jié)合形成交叉鍵，破壞DNA的復制而發(fā)揮抗腫瘤作用，但腫瘤對DDP存在的耐藥現(xiàn)象嚴重影響了其療效，甚至導致化療失敗。作者的研究結(jié)果顯示，DDP對胃癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞抑制率均不足30.00%，提示胃癌細胞對DDP存在明顯的原發(fā)性耐藥現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對DDP的耐藥性有可能提高化療的有效率并改善預后。

腫瘤的MDR涉及多種基因/蛋白表達和不同信號轉(zhuǎn)導通路協(xié)調(diào)的級聯(lián)樣網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)機制。目前發(fā)現(xiàn)與胃癌耐藥相關(guān)的因子有調(diào)節(jié)細胞凋亡的凋亡抑制蛋白 P53［5］、Survivin［6］及 Bcl-2［7］等，另外促凋亡蛋白 Bax［8］、具有解毒功能的 GST-π［9］和具有藥泵作用的MDR1/P-gp［10］等也在胃癌MDR中發(fā)揮作用。故該研究通過創(chuàng)建多元線性回歸模型，分析這6種因子的表達與DDP對胃癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞抑制率的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶中DDP對腫瘤細胞抑制率僅與GST-π呈負相關(guān)，在轉(zhuǎn)移灶中則與Survivin、Bcl-2呈負相關(guān)，而與P53呈正相關(guān)。作者還對比分析了胃癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移淋灶中6種MDR相關(guān)因子的表達，結(jié)果顯示，P-gp、GST、Bcl-2和Bax在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達強于原發(fā)灶，GST-π、Survivin在2種癌灶中的表達強度均無相關(guān)性。這一結(jié)果提示，在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間存在MDR異質(zhì)性，影響胃癌轉(zhuǎn)移灶DDP抑制率的主要耐藥相關(guān)因子與原發(fā)灶不同，與作者前期的研究［2］結(jié)果相符。

該結(jié)果中轉(zhuǎn)移灶P53表達與DDP對腫瘤細胞抑制率呈正相關(guān)，與突變型P53抑制細胞凋亡的功能［5］不符，推測這可能是由于P53表達作為細胞惡變的早期分子事件，僅在腫瘤早期起作用;另外，P53在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中受諸多其他因子影響，作用有所改變，且作者建立的多重線性回歸模型也可能造成結(jié)果與單因素分析不同。這更說明胃癌MDR的復雜性和建立準確多元線性回歸模型的必要性。

該研究初步證實了胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細胞對DDP均存在明顯的耐藥性，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中影響DDP藥敏性的MDR相關(guān)因子不同，但目前關(guān)于胃癌MDR的形成機制尚未完全明確，尚有許多其他因子及信號轉(zhuǎn)導通路參與其中。

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