張麗梅，馮 龍，張艷敏，馬 晶，趙國(guó)強(qiáng)，安玉會(huì)，鮑玉洲﹟

1)河南省眼科研究所分子生物室鄭州450003 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001

人表皮生長(zhǎng)因子慢病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)

張麗梅1，2)，馮 龍3)，張艷敏1)，馬 晶3)，趙國(guó)強(qiáng)3)，安玉會(huì)2)，鮑玉洲1，2)﹟

1)河南省眼科研究所分子生物室鄭州450003 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室鄭州450001 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001

#通訊作者，男，1955年10月生，研究員，研究方向:基因治療，E-mail:baoyuzhou@126.com

人表皮生長(zhǎng)因子;慢病毒載體;基因構(gòu)建

目的:構(gòu)建人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)慢病毒(LV)載體。方法:酶切并收集pcDNA 3.1-hEGF載體中的hEGF目的基因片段，克隆進(jìn)入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒載體內(nèi)，將所得重組體LV-GFP-hEGF與輔助載體pΔ8.2和pVSVG共同轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。收集上清液，按按10-1～10-7倍比稀釋后培養(yǎng)，檢測(cè)病毒滴度;裂解細(xì)胞，進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果:PCR擴(kuò)增、HindⅢ酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果均證實(shí)LV-GFP-hEGF構(gòu)建成功。將LV-GFP-hEGF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，紫外光下檢測(cè)可見(jiàn)綠色熒光;LV滴度達(dá)5×108TU/mL，轉(zhuǎn)染效率＞75%，Western Blot證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可表達(dá)hEGF。結(jié)論:成功構(gòu)建了含有GFP報(bào)告基因的hEGF慢病毒載體，包裝后的慢病毒可在293T細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。

人表皮生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor，hEGF)是人體內(nèi)促生長(zhǎng)因子家族成員之一，它不僅可以刺激角膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖分化，而且還能有效促進(jìn)組織損傷的愈合。作者將hEGF基因序列插入含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的慢病毒載體(lentivirus vector，LV)內(nèi)，完成hEGF慢病毒載體LV-GFP-hEGF的構(gòu)建，并將構(gòu)建的慢病毒在輔助包裝病毒載體pVSVG和pΔ8.2的共同作用下轉(zhuǎn)染到人胚腎293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，以便為hEGF促組織損傷修復(fù)作用機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 含有hEGF目的基因序列的pcDNA 3.1-hEGF真核表達(dá)載體由河南省眼科研究所分子生物室構(gòu)建并保存［1］，LV-GFP、pVSVG 和pΔ8.2包裝載體由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腫瘤研究所職慧軍教授惠贈(zèng)，大腸桿菌DH5α由河南省眼科研究所分子生物室保存。

1.1.2 細(xì)胞 293T細(xì)胞系由河南省眼科研究所分子生物室保存。

1.1.3 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶 HindⅢ、EcoRⅤ、MluⅠ、AVaⅢ及pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP及大量質(zhì)粒提取試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品;DNA Marker為大連寶生物公司產(chǎn)品;低熔點(diǎn)瓊脂糖為AMRESCO公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品;胎牛血清、DMEM、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品;磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;HIV p24蛋白ELISA試劑盒為Zeptometrix公司產(chǎn)品;兔抗人hEGF IgG抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，羊抗兔IgG抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)。

1.1.4 引物合成與設(shè)計(jì) 參照GenBank設(shè)計(jì)引物及連接子。連接子BL1、2及LV-GFP鑒定引物JDSIN1、2由金斯特科技有限公司合成，hEGF引物和T7、SP6通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 hEGF慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 首先將pcDNA 3.1-hEGF質(zhì)粒用MluⅠ和EcoRⅤ雙酶切，電泳和膠回收后得到目的片段，該片段分別含有MluⅠ酶切黏末端和EcoRⅤ酶切平末端，將此片段與 LV-GFP和 BL1、BL2連接子放在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行連接反應(yīng)?？傔B接反應(yīng)體系為10μL:其中含回收純化后的目的片段6μL，BL1和BL 2單鏈退火產(chǎn)物形成的連接子1μL，LV-GFP 1μL，T4 連接酶1μL，10 × 連接buffer 1μL;對(duì)照管加入6μL超純水代替目的片段，余同上。16℃過(guò)夜連接，得LV-GFP-hEGF。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，取菌液100μL均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增及鑒定 從含氨芐青霉素的LB平板上隨機(jī)挑取單菌落，在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)搖床培養(yǎng)細(xì)菌并提取質(zhì)粒，用JDSIN1和JDSIN2鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體積為30μL:其中 ddH2O 18.5μL，10 × buffer 3μL，dNTP 2μL，10 μmol/L 引物各 0.5μL，pfu DNA 聚合酶0.5μL，模板5μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min;94℃變性40 s，55℃ 退火45 s，68 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán);68℃延伸5min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，于18 g/L瓊脂糖凝膠電泳，判斷陽(yáng)性克隆。用HindⅢ對(duì)含有目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。挑選經(jīng)初步鑒定的重組體，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的hEGF序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 hEGF慢病毒載體的表達(dá)

1.3.1 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 采用磷酸鈣共沉淀法［2］將重組 LV-GFP-hEGF 質(zhì)粒 15 μg分別與 10 μg pΔ8.2包裝質(zhì)粒和5 μg pVSVG包膜質(zhì)粒，加水混合至總量為250μL，共轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)良好、細(xì)胞融合度達(dá)到50%～80%的單層293T細(xì)胞，用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)3 h后，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，連續(xù)培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3種質(zhì)粒在293T細(xì)胞中完成裝配并形成假病毒顆粒。分別于培養(yǎng)24、48及72 h后熒光燈下檢測(cè)培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度，待達(dá)到一定亮度時(shí)，收獲高滴度的慢病毒顆粒。

1.3.2 病毒滴度檢測(cè) 將293T細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，吸附6 h后，將所收集的含重組體的上清液分別按10-1～10-7倍比稀釋后，每孔按0.1 mL分別加入到相應(yīng)培養(yǎng)孔內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)24、48及72 h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算慢病毒轉(zhuǎn)染效率。超高速離心收集病毒上清液，用ELISA法對(duì)HIV病毒p24蛋白進(jìn)行滴度檢測(cè)［3］。

1.3.3 蛋白質(zhì)分析 刮取細(xì)胞，用生理鹽水漂洗3次，-80℃條件下反復(fù)凍融3次后超聲粉碎，離心棄細(xì)胞碎片，從上清液中提取并純化蛋白質(zhì)，比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，95℃水浴3min，4℃冷卻后，120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以兔抗人EGF為特異性一抗、羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western Blot分析，觀察目的蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 LV-GFP-hEGF的鑒定 見(jiàn)圖1、2。MluⅠ和EcoRⅤ雙酶切pcDNA 3.1-hEGF質(zhì)粒，膠回收后得到900 bp左右的目的片段，該目的片段、BL1與BL2連接子退火產(chǎn)物和LV-GFP 3連接后轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽(yáng)性克隆，用JDSIN1和JDSIN2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小為878 bp。從陽(yáng)性克隆提取的質(zhì)粒即LV-GFP-hEGF，用HindⅢ酶切鑒定，所得目的片段大小約為600 bp。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的hEGF序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)序列無(wú)誤。

2.2 LV-GFP-hEGF轉(zhuǎn)染效率及病毒滴度測(cè)定轉(zhuǎn)染239細(xì)胞24、48及72 h后，病毒轉(zhuǎn)染效率分別為(75.0 ± 4.1)%，(88.0 ± 4.0)% 和(87.4 ±4.0)%。轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞不再貼壁生長(zhǎng)，此時(shí)收集細(xì)胞上清液，用ELISA法針對(duì)HIV病毒p24蛋白檢測(cè)病毒滴度為5×108TU/mL。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hEGF蛋白的表達(dá) Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在hEGF蛋白的表達(dá)，hEGF相對(duì)分子質(zhì)量約為6 000。

3 討論

在多種內(nèi)源性生長(zhǎng)因子中，EGF對(duì)皮膚、角膜和胃腸道等組織的損傷修復(fù)過(guò)程均起著重要作用。通過(guò)外源性補(bǔ)充hEGF可顯著促進(jìn)皮膚、角膜及胃腸道等多種組織的損傷修復(fù)［4-7］。但由于EGF為小分子蛋白質(zhì)，半衰期短，僅1.5～3.5 h，在體內(nèi)易降解，需連續(xù)給藥方能保證有效的藥物濃度。因此如果選用合適的載體將hEGF基因直接導(dǎo)入機(jī)體組織損傷部位，使hEGF在受損傷部位組織細(xì)胞中持續(xù)分泌新鮮的EGF蛋白，對(duì)損傷部位組織細(xì)胞直接進(jìn)行持續(xù)性治療，必將有利于創(chuàng)面的愈合。

用人工構(gòu)建的方法剔除HIV-1的env、gag、pol和nef等致病基因區(qū)后，將保留下來(lái)的HIV-1其余部分序列構(gòu)建成LV，這種LV對(duì)人體已不具有傳染性，它只有在包膜質(zhì)粒pVSVG和包裝質(zhì)粒pΔ8.2共同作用下轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，才能裝配成假病毒顆粒。其中Δ8.2能夠提供假病毒裝配所必需的全部反式激活蛋白;VSVG編碼VSV-G包膜，應(yīng)用此包膜的LV拓寬了載體的嗜性范圍，增加了載體的穩(wěn)定性。在LV載體包裝過(guò)程中，宿主細(xì)胞能提供產(chǎn)生假病毒顆粒的必需蛋白。用LV作為載體具有如下特點(diǎn):①將外源目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，能長(zhǎng)期表達(dá)而不丟失。②容量大，可攜帶高達(dá)8 000 bp左右的外源基因，因此大多數(shù)目的基因都能被克隆入LV。③免疫原性低，不容易引起體內(nèi)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［8-9］。④可以兼容多種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，其中包括細(xì)胞特異性啟動(dòng)子等，應(yīng)用組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)LV中的外源基因，可使其在特定的組織細(xì)胞中表達(dá)，為慢病毒介導(dǎo)的基因靶向治療提供理論基礎(chǔ)。⑤轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)一般真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)到80%以上。正是由于LV的以上特點(diǎn)，使得它越來(lái)越受到人們的重視，成為最有希望用于臨床基因治療的載體之一。

作者的研究結(jié)果顯示成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)染效率高的LV-GFP-hEGF，其可在293T細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)hEGF蛋白，這對(duì)隨后進(jìn)行的角膜損傷疾病的基因治療具有重要指導(dǎo)意義。

［1］趙國(guó)強(qiáng)，張立華，王莉，等.人表皮生長(zhǎng)因子真核表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，39(4):603

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(2009-07-06收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Construction and expression of lentivirus vector for human epidermal growth factor

ZHANG Limei1，2)，F(xiàn)ENG Long3)，ZHANG Yanmin1)，MA Jing3)，ZHAO Guoqiang3)，AN Yuhui2)，BAO Yuzhou1，2)
1)Laboratory of Molecular Biology，Henan Eye Institute，Zhengzhou 450003 2)Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001
3)Department of Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

human epidermal growth factor;lentivirus vector;gene construct

Aim:To construct lentivirus vector(LV)of human epidermal growth factor(hEGF).Methods:hEGF target sequence in pcDNA-hEGF 3.1 vector was cut，extracted and inserted into LV which contained green fluorescence protein(GFP)gene，then the recombinant LV-GFP-hEGF was cotransfected into human embryonic kidney 293T cells along with assisting vectors pΔ8.2 and pVSVG to package the virus.The supernatant was extracted，attenuated according to different titer，and cultivated，the virus titer was detected，and the cells were clearaged and analyzed with Western Blot.Results:LVGFP-hEGF was constructed successfully，and could express in 293T cells.The virus titer was 5 ×108TU/mL.Conclusion:LV which contained GFP and hEGF gene has been constructed successfully，and the packaged lentivirus could express effectively in 293T cells.

Q789