趙天才，楊景鋒，李月紅，袁志敏，張 瑛，李 鵬，張瀚元

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖(簡稱血糖)水平增高為特征的代謝性疾病[1]。其發(fā)病率高，并發(fā)癥遍及全身各重要器官。血管病變是各并發(fā)癥的基礎(chǔ)病變，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是形成糖尿病血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)[2]。血管性血友病因子(vWF)和糖化血紅蛋白(HbA1c)可以有效反映糖尿病血管內(nèi)皮功能的狀態(tài)和血糖水平對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察抵當(dāng)芪桂湯(原名抵當(dāng)四五湯)對糖尿病大鼠vWF和HbA1c含量的影響，探討該方對糖尿病及其并發(fā)癥的作用機(jī)理，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品及主要試劑

成年SD雌性大鼠90只，體重200g±20g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字第2008-08號(hào)。抵當(dāng)芪桂湯由生黃芪、炒白芍、酒大黃、桂枝、水蛭、鬼箭羽組成。給藥劑量按照文獻(xiàn)方法計(jì)算[3]，經(jīng)常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥量分別為0.87g和1.73g的濃縮液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。達(dá)美康:天津華津制藥廠，批號(hào)080405;鏈脲佐菌素(STZ):sigma公司，批號(hào)SO245;血糖試紙:德國羅氏診斷有限公司，批號(hào)1630-2005;vWF試劑盒:上海西唐生物技術(shù)有限公司，批號(hào)081023;HbA1c試劑盒:南京建成生物工程研究所，批號(hào)20081120;722E型分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;全活力型羅康全血糖儀:德國羅氏診斷公司;1379型洗板機(jī):北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司;RT-2100C型酶標(biāo)儀:上海光達(dá)電器廠。

1.2 模型制備及干預(yù)方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，稱體重并經(jīng)尿糖定性檢測為陰性后隨機(jī)抽取10只為空白組(A組)，其余大鼠用鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg(STZ溶于0.1mol/L、ph4.2的枸櫞酸緩沖液中，配制為1%的溶液)于大鼠禁食12h后1次性腹腔注射，72h后測其血糖值≥16.9mmol/L、尿糖+++～++++以上為造模成功。篩選造模成功大鼠65只隨機(jī)分為模型組(B組)、達(dá)美康組(C組)、抵當(dāng)芪桂湯組(D組)、抵當(dāng)芪桂湯加達(dá)美康組(E組)、抵當(dāng)芪桂湯大劑量組(F組)，每組13只。各組大鼠造模后第4天開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)8周。給藥劑量分別為:A、B組:蒸餾水2ml;C組:達(dá)美康(2mg/ml)混懸液2ml;D組:抵當(dāng)芪桂湯(含生藥量0.87g/ml)濃縮液2ml;E組:抵當(dāng)芪桂湯(0.87g/ml)濃縮2ml，30min后給予達(dá)美康(2mg/ml)混懸液2ml;F組:抵當(dāng)芪桂湯(生藥量1.73g/ml)濃縮液2ml。

1.3 觀察指標(biāo)及標(biāo)本采集

每天觀察大鼠進(jìn)食、飲水、尿量及活動(dòng)情況;給藥后第8周末處死動(dòng)物，右心室取血，其中4ml置以肝素抗凝管中，用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖，比色法測HbA1c;剩余血液置離心管中，4℃離心取血清分裝，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫⒂肊LISA雙抗體夾心法檢測vWF的含量。剪取心尖部心肌組織用10%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟切片4μm，脫水透明，HE染色，10×40倍光鏡下觀察攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用簡單線性相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況

造模前各組大鼠精神狀態(tài)、飲食、尿量正常，均反應(yīng)靈活，動(dòng)作自如。造模后大鼠表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，形體消瘦，嗜睡少動(dòng)，精神倦怠。給藥8周后，C、D、E、F組多飲、多食、多尿癥狀有不同程度減輕，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，與A組比較次之;B組上述癥狀變化不明顯。

2.2 抵當(dāng)芪桂湯對大鼠空腹血糖的影響

表1顯示，造模3d后與空白組比較，STZ誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠空腹血糖明顯升高(P<0.05)，表明造模成功。干預(yù)結(jié)束后，與B組比較各干預(yù)組大鼠空腹血糖均明顯下降(P<0.05)，其中以C組下降明顯。

表1 治療前后各組大鼠空腹血糖含量比較(s)

表1 治療前后各組大鼠空腹血糖含量比較(s)

注:*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group.A:blank control group，B:model group， C:diamicron group D:Di-Dang-Qi-Gui Decoction group E:Di-Dang-Qi-Gui Decoction and diamicron group F:maximum dosage group of the Decoction，the same below

Group n Blood Glucose(mmol/L)3rd day 8th week A 10 6.26±0.44 5.95±0.58 B 11 23.43±3.07* 25.55±2.72*C 12 21.09±2.05* 13.34±2.76*#D 13 22.54±3.36* 19.49±3.09*#E 13 23.51±2.44* 19.28±4.90*#F 13 21.91±3.05* 20.38±5.11*#

2.3 抵當(dāng)芪桂湯對大鼠vWF、HbA1c含量的影響

表2顯示，干預(yù)結(jié)束后與A組比較，B組vWF、HbA1c明顯升高(P<0.05)，表明糖尿病血管病變中vWF隨著HbA1c增高而急劇增高;與B組比較，各干預(yù)組大鼠vWF、HbA1c含量均降低，其中以D組降低最為顯著(P<0.05)，D組與C組相比差異顯著(P<0.05)。

表2 治療8周后各組大鼠vWF、HbA1c含量比較(s)

表2 治療8周后各組大鼠vWF、HbA1c含量比較(s)

*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group，<0.05 vs.C group

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2.4 vWF、HbA1c的相關(guān)性分析

圖1顯示，對vWF、HbA1c的相關(guān)性進(jìn)行分析，可以看出隨著HbA1c的升高，vWF呈現(xiàn)急劇升高的趨勢，其相關(guān)系數(shù)為r=0.9692(P<0.0001)，具有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

圖1 大鼠vWF與HbA1c的相關(guān)關(guān)系圖

2.5 各組大鼠心肌組織形態(tài)特征的變化

圖2顯示，正常大鼠心肌細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞間質(zhì)較少，細(xì)胞核分布均勻一致，肌纖維整齊，無明顯斷裂。STZ誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)及間質(zhì)膠原較多，間質(zhì)纖維化明顯，肌纖維部分?jǐn)嗔?。?jīng)干預(yù)后各組大鼠的心肌細(xì)胞排列紊亂有不同程度的恢復(fù)，其中以C組和D組恢復(fù)較為明顯。

圖2 各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)圖(HE×400)

3 討論

糖尿病因代謝紊亂引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮介質(zhì)的異常釋放是內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂的標(biāo)志[4、5]。vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，貯存于血管內(nèi)皮細(xì)胞(Weibel-palade)的小體、血小板及血漿中，其主要參與凝血機(jī)制和活化血小板的功能[6]。高血糖時(shí)可使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血漿vWF含量升高[7]。vWF是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙的標(biāo)志物，在血小板與血管壁的結(jié)合中起重要的橋梁作用。當(dāng)血小板活化時(shí)，vWF一端與血小板膜糖蛋白Ib結(jié)合，另一端與血管壁纖維連接蛋白及膠原結(jié)合，使血小板能牢固地黏附在血管內(nèi)皮下，血管受損，基底膜膠原暴露，除激活因子xII啟動(dòng)內(nèi)原性凝血機(jī)制外，內(nèi)皮細(xì)胞還表達(dá)并釋放vWF導(dǎo)致血小板在損傷部位黏附聚集形成血栓，阻塞血管腔，造成微循環(huán)障礙，使血管內(nèi)皮功能異常，從而參與糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展[8]。糖化血紅蛋白(HbAIc)可監(jiān)測血糖長期控制情況，也能反映體內(nèi)糖代謝情況[9]。是血紅蛋白A組分的某些結(jié)構(gòu)與葡萄糖的非酶促反應(yīng)結(jié)合而形成的產(chǎn)物，體內(nèi)血糖升高能加速HbA1c的這種生理過程，使血紅蛋白與2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的結(jié)合減低，血紅蛋白對氧的親合力增高，氧離曲線左移，造成組織缺氧，致使血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝障礙受損而形成糖尿病血管病變[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著血糖的增高，HbA1c逐漸增高，vWF也隨著HbA1c的增高而急劇增高，表明糖尿病血管病變的發(fā)生與糖尿病血糖水平的高低呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系，且與相關(guān)報(bào)道相符[11]。達(dá)美康在降低血糖方面療效顯著，而在降低vWF方面卻不及抵當(dāng)芪桂湯，考慮抵當(dāng)芪桂湯在降低vWF方面可能還有著多層次的作用靶點(diǎn)。而抵當(dāng)芪桂湯不同劑量對實(shí)驗(yàn)大鼠有不同程度降低vWF和HbAlc含量的作用，提示中藥的量效關(guān)系也是本方進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，其中抵當(dāng)芪桂湯正常劑量組治療效果優(yōu)于抵當(dāng)芪桂湯加達(dá)美康組和抵當(dāng)芪桂湯大劑量組，考慮可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耐受性有關(guān)。

糖尿病是慢性病理過程，可有陰虛熱盛-氣陰兩虛-陰陽兩虛的演變。因久病多虛，久病多瘀，最終導(dǎo)致氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻。糖尿病血管病變是在陰虛熱盛的基礎(chǔ)上發(fā)生和演變的，同時(shí)伴有脈絡(luò)瘀滯。當(dāng)病邪侵襲脈絡(luò)傷及絡(luò)氣，使絡(luò)氣郁滯導(dǎo)致津血互化障礙，津凝為痰，血滯為瘀，痰瘀阻滯絡(luò)脈，血行不暢，從而形成痰瘀阻絡(luò)的病理狀態(tài)。氣血耗損無以榮養(yǎng)絡(luò)脈，致絡(luò)虛不榮傷及形質(zhì)。抵當(dāng)湯芪桂湯是以張仲景抵當(dāng)湯、黃芪桂枝五物湯化裁而成，方中生黃芪益氣固表，炒白芍養(yǎng)陰生津?yàn)榫?酒大黃活血化瘀，水蛭化瘀通絡(luò)，桂枝溫通經(jīng)脈為臣藥;鬼箭羽活血化瘀為佐藥，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)之功，適用于糖尿病及其并發(fā)癥屬氣陰兩虛、絡(luò)脈瘀阻證?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪在缺糖缺氧的條件下，具有保護(hù)細(xì)胞的作用，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的活性;白芍提取物有抗血栓的作用;大黃有降低血糖和糖化血紅蛋白，改善糖代謝的作用;水蛭具有抗凝血、抗血栓的作用;桂枝能增加冠脈血流量，擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán);鬼箭羽亦有改善血液流變性，降低血糖和調(diào)節(jié)血脂的作用。

綜上所述，vWF是反應(yīng)血管內(nèi)皮功能方面的標(biāo)志蛋白之一，與HbA1c有著密切的聯(lián)系。抵當(dāng)芪桂湯通過降低vWF及HbA1c含量以改善血管內(nèi)皮功能，可能是該方防治糖尿病及其并發(fā)癥的作用機(jī)理之一。

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