孫 鑫，鄭洪新，燕 燕，王思程，尚德陽(yáng)，鄧洋洋，李 楠

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110032)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增高的一種全身性骨骼疾病[1]。本病發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其發(fā)生與諸多因素有關(guān)。

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，由多種同工酶亞型組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，以其活性依賴于Ca2+而得名，參與多種生命活動(dòng)，如蛋白磷酸化、信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖和分裂、跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)、平滑肌收縮、基因表達(dá)等[2]。本實(shí)驗(yàn)選取PKCα與PKCβ2作為研究對(duì)象，應(yīng)用補(bǔ)腎益髓中藥對(duì)模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制以及補(bǔ)腎益髓中藥的防治作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雌性4～5月齡wistar大鼠，169只，體重230g～270g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物

實(shí)驗(yàn)藥品:補(bǔ)腎壯骨益髓中藥(牡蠣、鹿茸等);對(duì)照藥品:骨疏康顆粒劑(遼寧康辰藥業(yè)有限公司);蓋天力片(東盛科技啟東蓋天力制藥股份有限公司);健脾中藥(補(bǔ)中益氣湯方由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供)。

1.3 試劑

兔抗 PKCα-抗 (Santa Cruz)、兔抗 PKCβ2-抗(Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中山生物公司)、堿性磷酸酶(ALP)偶聯(lián)的羊抗兔抗體(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

1組:正常組;2組:假手術(shù)組;3組:模型空白組(?？战M);4組:補(bǔ)腎中藥低劑量組(低劑量組);5組:補(bǔ)腎中藥高劑量組(高劑量組);6組:補(bǔ)中益氣湯對(duì)照組(健脾組);7組:蓋天力鈣片對(duì)照組(蓋天力組);8組:骨疏康顆粒對(duì)照組(骨疏康組)。

2.2 造模方法

手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法(去勢(shì)法)造骨質(zhì)疏松癥模型。假手術(shù)組大鼠只切開皮膚及皮下組織，暴露雙側(cè)卵巢但不摘除。正常組不手術(shù)。

2.3 飼養(yǎng)方法

正常組及假手術(shù)組大鼠正常飲食不灌胃，其他各組大鼠正常飲食并給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，共3個(gè)月。藥物劑量:大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計(jì)算，容積為0.875ml/100g體重。

2.4 取材

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠經(jīng)10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g體重)后用碘伏消毒手術(shù)部位，采集標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)保留標(biāo)本包括下丘腦(置高壓滅菌EP管內(nèi)－70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鮮袋內(nèi)－70℃冰箱凍存)、子宮(稱取濕重)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

3.1.1 骨密度 通過雙能X線骨密度分析儀(附帶“The Small Subject Scout Scan”軟件)對(duì)大鼠離體股骨進(jìn)行檢測(cè)(掃描寬度15cm，長(zhǎng)度可任意調(diào)節(jié)，掃描速度40mm/s，分辨率為1.0×1.0mm;結(jié)果采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量(g/cm2)表示)，所得結(jié)果如下:與正常組比較，?？战M大鼠股骨頭骨密度顯著降低(P<0.01);與模型空白組比較，補(bǔ)腎中藥高劑量組可顯著增加骨密度(P<0.01)，而健脾中藥作用不明顯，與補(bǔ)腎中藥高劑量組差異顯著(P<0.01)。

3.1.2 子宮指數(shù) 實(shí)驗(yàn)大鼠子宮指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組、假手術(shù)組相比較，?？战M子宮指數(shù)明顯降低(P<0.01)。

表1 各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(s)

表1 各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(s)

注:與正常組比較:*P<0.05;與正常組比較:**P<0.01;與?？战M比較:#P<0.05，與?？战M比較:##P<0.01;與低劑量比較:●P<0.05;與低劑量比較:●●P<0.01;與高劑量比較:☆P<0.05，與高劑量比較:☆☆P<0.01

組別 n 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 組 15 0.16433±0.01466##假 手 術(shù) 組 17 0.15582±0.01138##模 空 組 21 0.14700 ±0.01035**低 劑 量 組 21 0.15186 ±0.01285**☆高 劑 量 組 21 0.16095±0.01593##●健 脾 組 19 0.14211 ±0.01127**●☆☆骨 疏 康 組 20 0.14835 ±0.01483**☆☆蓋 天 力 組 20 0.15695±0.00778#

表2 各組藥物對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松大鼠子宮指數(shù)影響的比較(s)

表2 各組藥物對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松大鼠子宮指數(shù)影響的比較(s)

注:同表1～1

組別n子宮指數(shù)(s)正 常 組 15 2.0434±0.7178##假 手 術(shù) 組 17 1.8195±0.4311##模 空 組 21 0.2859 ±0.0469**低 劑 量 組 21 0.2930 ±0.0501**高 劑 量 組 21 0.3110 ±0.0694**健 脾 組 19 0.2773 ±0.0435**骨 疏 康 組 20 0.2835 ±0.0170**蓋 天 力 組 20 0.2888±0.0684**

3.1.3 大鼠行為學(xué)指標(biāo) 正常組大鼠皮毛光澤，活潑喜動(dòng)，反應(yīng)靈敏，食欲佳，無(wú)豎毛、弓背、聚堆等表現(xiàn)。?？战M大鼠均出現(xiàn)弓背塌腰表現(xiàn)，其他表現(xiàn)如毛色變淡、蜷縮、聚堆、反應(yīng)遲鈍、喜靜懶動(dòng)、抗應(yīng)激能力下降等癥狀不十分明顯，各劑量補(bǔ)腎中藥組及陽(yáng)性對(duì)照組的弓背塌腰表現(xiàn)較模空組為輕。用藥各組弓背塌腰癥狀改善率為:低劑量組33.3%，高劑量組52.4%，健脾組15.8%，蓋天力組30%，骨疏康組25%。

從以上結(jié)果分析，本次實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松癥大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰癥狀為腎虛模型的表征信息，補(bǔ)腎各組優(yōu)于健脾組。

3.2 下丘腦組織中PKCα、PKCβ2蛋白表達(dá)

3.2.1 檢測(cè)方法 Western blotting法檢測(cè)大鼠下丘腦組織中PKCα、PKCβ2蛋白表達(dá)。經(jīng)Scion Image軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 大鼠下丘腦組織中PKCα Western blotting結(jié)果

3.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大鼠下丘腦組織中PKCα、PKCβ2的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與正常組相比，?？战M顯著增高(P<0.01);與?？战M相比，低劑量組、高劑量組、健脾組、蓋天力組、骨疏康組均有顯著降低(P<0.01);與低劑量組相比，高劑量組、健脾組、蓋天力組、骨疏康組有顯著差異(P<0.01)。補(bǔ)腎各組與補(bǔ)脾組蛋白表達(dá)較?？战M降低，趨近正常組，均有改善作用，但補(bǔ)腎中藥優(yōu)于健脾中藥。

圖2 大鼠下丘腦組織中PKCβ2Western blotting結(jié)果

表3 大鼠下丘腦組織中PKCα、β2 Western blotting結(jié)果對(duì)比(s，n=6)

表3 大鼠下丘腦組織中PKCα、β2 Western blotting結(jié)果對(duì)比(s，n=6)

注:同表1～1

組 別 PKCα的蛋白表達(dá) PKCβ2的蛋白表達(dá)正 常 組 27.88857± 2.545057##☆☆ 24.58286±1.809399##☆☆假 手 術(shù) 組 33.15586± 2.690432##☆☆ 26.24429±1.603588##☆☆模 空 組 158.55000±18.89263**☆☆ 146.6129±7.179045**☆☆低 劑 量 組 47.48000± 4.364485##☆☆ 25.35429±1.912711##☆☆高 劑 量 組 32.88857± 2.89289##**●● 14.08429 ±1.139735##**●●健 脾 組 25.24000± 2.321472##**●● 13.73429±0.960917##**●●骨 疏 康 組 22.71286± 1.832109##**●●☆☆ 3.67571±0.611742##**●●☆☆蓋 天 力 組 26.37571± 2.204373##**●● 12.69714±1.078884##**●●

4 討論

4.1 骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的選擇

大鼠分布廣，繁殖快，生命周期短，便于飼養(yǎng)，費(fèi)用較低，是目前研究骨質(zhì)疏松使用最多、最成熟的造模動(dòng)物。Wistar大鼠具有對(duì)傳染病抵抗力較強(qiáng)、自發(fā)性腫瘤發(fā)生率低等特點(diǎn)，十分適合用來(lái)進(jìn)行與老年性疾病相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。骨質(zhì)疏松的模型也較多，包括去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥模型、老年性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型、維甲酸致骨質(zhì)疏松模型、尾部懸吊模型等。本實(shí)驗(yàn)采用的去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥模型是一種比較成熟的模型，其作用因素單一，模型確認(rèn)好，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高，適用范圍廣，具有方便性、關(guān)聯(lián)性、適應(yīng)性3個(gè)特點(diǎn)，能很好地模擬絕經(jīng)后所表現(xiàn)出來(lái)的骨量丟失與骨結(jié)構(gòu)的一系列變化。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、世界衛(wèi)生組織都推薦用此模型作為研究骨質(zhì)疏松的最佳模型。當(dāng)然模型還存在一定的局限性，如單純卵巢切除，無(wú)法完全模擬人類女性絕經(jīng)前后的復(fù)雜情況，與臨床實(shí)際情況有所差異。

在本實(shí)驗(yàn)中用該模型來(lái)模擬女性由于雌激素缺乏而引起的骨質(zhì)疏松癥，與《素問·上古天真論》中“天癸竭，地道不通，形壞而無(wú)子”的描述相符，由于腎中精氣衰竭、月經(jīng)閉絕，而使骨枯髓減導(dǎo)致“骨痿”。中醫(yī)通過外在表現(xiàn)判斷臟腑的變化，又可以“藥”驗(yàn)“證”，通過觀察去卵巢動(dòng)物模型術(shù)后早期階段如弓背塌腰等一系列的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其存在典型的腎虛癥狀，應(yīng)用補(bǔ)腎中藥后這些癥狀緩解或消失，由此證明此模型屬腎虛。

4.2 骨質(zhì)疏松癥與腎、腦的關(guān)系

中醫(yī)認(rèn)為腎主骨，骨病首責(zé)于腎，而腎與腦的關(guān)系十分密切?！澳I藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)”(《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義·臟腑所合》清·唐宗海)，十分精辟地總結(jié)了腎、腦、骨這三者的關(guān)系。腎虛的機(jī)制是復(fù)雜的，有觀點(diǎn)認(rèn)為腎虛可能與“下丘腦-垂體-性腺軸”功能的減退有關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病的研究也表明，本病的發(fā)生是各系統(tǒng)綜合作用的結(jié)果，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)是研究的方向之一，并已有相關(guān)的研究。結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥大鼠下丘腦組織中一些因子的變化與本病具有一定的相關(guān)性。基于以上原因，本實(shí)驗(yàn)選取下丘腦進(jìn)行研究。

4.3 PKC與骨質(zhì)疏松癥的研究

1997年崔家鵬等對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松癥大鼠紅細(xì)胞膜PKC的活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，腎虛骨質(zhì)疏松癥模型大鼠紅細(xì)胞膜PKC的活性明顯降低，經(jīng)密骨靈治療模型大鼠與正常組接近[3]。2003年谷野等進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，含密骨顆粒劑的血清可使UMR106成骨樣細(xì)胞中的PKC活性增強(qiáng)，且主要以cPKCβ為主，并能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的增殖。成骨細(xì)胞是骨代謝過程中的重要細(xì)胞，其增殖有利于骨的形成[4]。

4.4 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的討論

在本次實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)腎中藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近正常組，其他用藥組與正常組存在顯著差異。補(bǔ)腎中藥防治骨質(zhì)疏松的效果優(yōu)于健脾中藥，一方面說(shuō)明補(bǔ)腎中藥的有效性，另一方面根據(jù)中醫(yī)以藥驗(yàn)證的理論說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型屬腎虛證。

在實(shí)驗(yàn)中，大鼠下丘腦中PKCα與PKCβ2蛋白表達(dá)的變化明顯，?？战M大鼠與正常組大鼠存在顯著差異，說(shuō)明骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生可能與下丘腦中蛋白激酶的變化密切相關(guān)，而PKC的變化可能是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。補(bǔ)腎、健脾中藥均可調(diào)節(jié)下丘腦中PKCα與PKCβ2蛋白表達(dá)，且補(bǔ)腎中藥優(yōu)于健脾中藥，說(shuō)明PKC的變化可能與多方面因素相關(guān)。另外，PKC的變化也有可能是腎虛發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制之一，但本次實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步研究其具體作用的過程，有待在今后的研究中深入探討。

[1]劉忠厚.骨質(zhì)疏松學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，1998.142.

[2]陳敏，唐建武.PKC亞型的生物學(xué)特性與調(diào)節(jié)功能[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2002，22(5):493-496.

[3]谷野，鄭洪新.含密骨顆粒劑血清對(duì)UMR106成骨樣細(xì)胞增殖及PKC活性的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2003，30(7):575-577.

[4]崔家鵬，鄭洪新，劉景峰，等.補(bǔ)腎中藥對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松癥大鼠紅細(xì)胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1997，3(3):66-69.