孫喜明,李 興,王桂英,田立華,張慧榮

糖尿病腎病已成為糖尿病患者死亡的主要原因,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白表達(dá)增多并抑制其降解。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種腎營(yíng)養(yǎng)因子。但HGF在糖尿病腎病中的作用仍是有爭(zhēng)議的。本研究給予2型糖尿病腎病大鼠腹腔注射重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ,利用RT-PCR檢測(cè)腎臟TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA表達(dá)和病理變化,觀察HGF對(duì)2型糖尿病腎病不同階段的治療作用。

1 材料與方法

1.1 模型建立 4周～8周的雄性Wistar大鼠60只,體重220 g～250 g,隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組)、糖尿病腎病組(DN組)、治療組(HGF組)。NC組和DN組大鼠 36只,喂以高糖、高脂飼料2月后,腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ,由 Sigma公司提供),30 mg/kg。1月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,確定為2型糖尿病大鼠。HGF組共12只,糖尿病鼠成模后2個(gè)月,隨機(jī)取6只給予HGF 500 μ g/(kg?d),皮下注射,連續(xù)1個(gè)月,隨后處死;另外6只于糖尿病鼠成模后6個(gè)月,給予hHGF 500 μ g/(kg?d),皮下注射,連續(xù)1個(gè)月,隨后處死。DN組:共24只,分別于糖尿病鼠成模后2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月后,隨機(jī)取6只處死;對(duì)照組24只,喂以低糖、低脂飲食,隨機(jī)取6只,分別與DN組同時(shí)處死。

1.2 血糖與尿蛋白的測(cè)定 每周測(cè)血糖1次。分別于注射后2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和7個(gè)月在代謝籠中收集尿液,測(cè)定 24 h尿白蛋白排泄率。

1.3 TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、c-metmRNA 的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCD檢測(cè),引物序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。經(jīng)紫外凝膠圖像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以目的基因mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的光密度值與GAPDHmRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物光密度值的比值作為目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)值。

1.4 病理觀察 常規(guī)HE染色,在JEOL-100型透射電鏡下觀察腎小球基膜的改變。光鏡下用M IAS-2000圖像分析綜合系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)測(cè)定腎小球體積。電鏡照片亦采用該系統(tǒng)測(cè)定腎小球基膜平均厚度(GBM T)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖變化 HGF組和DN組大鼠在注射STZ1個(gè)月后,空腹血糖≥7.0 mmol/L,且各組大鼠組間及不同時(shí)間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠尿白蛋白(Alb)的變化 HGF組和DN組大鼠于注射STZ2個(gè)月后尿白蛋白與對(duì)照組相比明顯增加(P＜0.05),與人早期糖尿病腎病相似。3個(gè)月時(shí),HGF組尿白蛋白無(wú)明顯變化,但DN組尿白蛋白明顯增加(P＜0.05);6個(gè)月時(shí),HGF組和DN組出現(xiàn)大量的蛋白尿,與人臨床糖尿病腎病相似,且HGF組與DN組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;7個(gè)月時(shí),HGF組尿白蛋白較6個(gè)月時(shí)尿蛋白明顯減少,而DN組尿蛋白較6個(gè)月時(shí)明顯增加(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

表1 各組大鼠24 h尿白蛋白排泄率(±s)mg

組別 n 高熱量飲食2個(gè)月 注射STZ1月 注射STZ2月 注射STZ3月 注射STZ6月 注射STZ7月對(duì)照組 6 3.88±0.78 4.60±0.59 4.58±0.58 4.68±0.54 4.64±0.62 4.76±0.68 DN 組 6 3.85±0.87 5.08±0.24 12.76±6.251) 17.26±0.72 24.24±1.081) 28.35±0.861)HGF組 6 3.89±0.83 4.73±0.70 13.65±3.581) 13.98±0.651)2) 25.23±0.581) 18.86±0.461)2)與對(duì)照組比較,1)P＜0.01;與DN組比較,2)P＜0.01

2.3 各組大鼠腎臟的病理變化 DN組大鼠2月時(shí)腎小球肥大,腎小球基膜和系膜基質(zhì)輕度增加,可見(jiàn)少量的荒廢腎小球;3個(gè)月時(shí),DN組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)進(jìn)一步增厚,荒廢的腎小球進(jìn)一步增加,而HGF組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)未見(jiàn)明顯進(jìn)一步增厚,荒廢的腎小球未見(jiàn)明顯增加。DN組大鼠6個(gè)月時(shí)GBM明顯增厚,系膜基質(zhì)明顯增寬,可見(jiàn)大量荒廢的腎小球,殘余腎小球代償性肥大;7個(gè)月時(shí),DN組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)進(jìn)一步增厚,荒廢的腎小球進(jìn)一步增加,而HGF組大鼠腎小球基膜和系膜基質(zhì)厚度較6個(gè)月時(shí)明顯減輕,荒廢的腎小球數(shù)量明顯減少。詳見(jiàn)表2。

表2 各階段腎臟病理形態(tài)學(xué)的變化(±s)

表2 各階段腎臟病理形態(tài)學(xué)的變化(±s)

時(shí)段 腎小球體積V(μ m3)腎小球基膜厚度GBM T(μ m)對(duì)照組 DN組 HGF組 對(duì)照組 DN組 HGF組高熱量飲食2月 323±34 321±50 4 362±366 4 366±362注射STZ1月 320±31 367±351)注射STZ2月 299±30 402±292)4 604±1396 7 480±1 4661)注射 STZ3月 332±56 275±252) 389±652)4) 4 615±1 325 9 886±1 1382) 7 639±1 2371)2)3)注射 STZ6月 339±36 254±382) 4 357±1 021 1 1297±1 6892)注射 STZ7月 325±45 198±342) 279±331)4) 4 126±986 1 3867±1 6892) 8 565±1 3232)4)5)與對(duì)照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與DN組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與DN組治療前比較,5)P＜0.05

2.4 各組大鼠 TGF-β1,c-met及 CTGF mRNA的表達(dá)變化在3個(gè)月時(shí),DN組 TGF-β1及CTGFmRNA表達(dá)較對(duì)照組及HGF組和 DN組 2個(gè)月時(shí)高。在 6個(gè)月時(shí),DN組 c-met mRNA表達(dá)較3個(gè)月和2個(gè)月時(shí)進(jìn)一步降低,TGF-β1及CTGFmRNA表達(dá)較3個(gè)月和2個(gè)月時(shí)顯著增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在7個(gè)月時(shí),HGF組 c-met mRNA表達(dá)較DN組6個(gè)月及7個(gè)月時(shí)高,TGF-β1及CTGFmRNA表達(dá)較DN組6個(gè)月及7個(gè)月時(shí)低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖 1、圖 2、圖 3。

圖3 各組大鼠c-met mRNA的表達(dá)

3 討 論

糖尿病腎病的典型病理改變是腎小球硬化,而尿白蛋白是反映腎小球功能的主要指標(biāo)。本研究建立糖尿病及2型糖尿病腎病大鼠模型。糖尿病大鼠2個(gè)月時(shí),DN組和HGF組尿白蛋白排泄率(UAER)顯著高于對(duì)照組,腎小球肥大,腎小球基膜和系膜基質(zhì)輕度增厚,與人早期糖尿病腎病的發(fā)病相似。糖尿病大鼠6個(gè)月時(shí)出現(xiàn)大量蛋白尿,為非選擇性蛋白尿,GBM明顯增厚,系膜基質(zhì)增寬,荒廢的腎小球增多,殘余腎小球代償性肥大,與人臨床糖尿病腎病相似。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明,DN的發(fā)病實(shí)際上是多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及激素等對(duì)過(guò)高血糖的綜合反映結(jié)果。生長(zhǎng)因子如TGF-β1和CTGF在DN發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,這些生長(zhǎng)因子使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白表達(dá)增多并抑制其降解[1],而ECM在腎小球的異常沉積是引起腎小球硬化的主要原因之一。高血糖、糖化終末產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生活性氧物質(zhì)并刺激TGF-β1上調(diào),TGF-β1反過(guò)來(lái)上調(diào) CTGF的表達(dá),也誘發(fā)高血糖。高血糖誘發(fā)了腎臟一系列事件,最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[2]。腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)行性損害直至腎衰的最后共同通路。腎小球或腎小管間質(zhì)損傷,炎性細(xì)胞侵入,促進(jìn)纖維化的因子(TGF-β1、CTGF)生成增加,抑制纖維化的因子(HGF)生成減少,成肌纖維細(xì)胞形成及增殖,ECM積聚。在眾多促纖維化的因子中,TGF-β1被認(rèn)為是最重要的促纖維化因子之一,它在腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中扮演著極為重要的角色[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察到,糖尿病大鼠在3個(gè)月時(shí),腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)明顯增高,同時(shí)蛋白尿進(jìn)一步增加,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),TGF-β1mRNA的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),尿蛋白進(jìn)一步增多,GBM和腎小球系膜進(jìn)一步增厚。

CTGF曾被認(rèn)為在纖維化過(guò)程中是TGF-β的下游調(diào)控因子[4]。然而,CTGF可不依賴TGF-β被誘導(dǎo)表達(dá)增高,大量研究表明高糖環(huán)境下,CTGF在腎小球膜細(xì)胞表達(dá)增加,導(dǎo)致ECM沉積[5]。CTGF在包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎病的腎臟纖維化中過(guò)度表達(dá)[1]。本實(shí)驗(yàn)觀察到,糖尿病大鼠在3個(gè)月時(shí),CTGFmRNA表達(dá)明顯增高,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),CTGFmRNA的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),GBM和腎小球系膜進(jìn)一步增厚,即:CTGFmRNA的表達(dá)與糖尿病腎病腎臟纖維化密切相關(guān)。CTGF和 TGF-β1使ECM 蛋白表達(dá)增多并抑制其降解,造成細(xì)胞肥大,最終導(dǎo)致腎臟纖維化。

HGF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種腎營(yíng)養(yǎng)因子。HGF是間質(zhì)來(lái)源的多效性生長(zhǎng)因子,在多種慢性腎病中具有抗纖維化和促進(jìn)再生的功能。HGF的作用是由其受體c-met介導(dǎo)的,c-met屬于氨酸激酶受體超家族[6]。

在急性和慢性腎衰的情況下,HGF通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞中間質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序化來(lái)參與損傷和纖維化后腎組織的重修和再生,發(fā)揮其預(yù)防和治療的作用[7]。因此,補(bǔ)充給予HGF以降低TGF-β和CTGF水平從而治療腎纖維化和慢性腎衰。本實(shí)驗(yàn)給予早期糖尿病腎病大鼠HGF治療,抑制了TGF-β1和CTGFmRNA表達(dá)的上調(diào),雖然早期糖尿病大鼠腎臟的形態(tài)和功能未見(jiàn)明顯改善,但是早期糖尿病大鼠的尿蛋白未見(jiàn)明顯增加、GBM和系膜基質(zhì)未見(jiàn)進(jìn)一步增厚;這可能與TGF-β1破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的電荷屏障及分子屏障,而此時(shí)腎臟纖維化較輕有關(guān);因而HGF可抑制早期糖尿病腎病的進(jìn)一步發(fā)展。

在糖尿病腎病的治療中,HGF可通過(guò)上調(diào)c-metmRNA的表達(dá),抑制TGF-β1和 CTGF等致纖維化生長(zhǎng)因子的作用的途徑來(lái)抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化,而起到保護(hù)腎結(jié)構(gòu)和維護(hù)腎功能的作用,具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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