董 莎,劉瑞珍,李曉東

腦缺血再灌注損傷是多數(shù)缺血性腦血管疾病的主要病理生理過(guò)程[1],近年研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡主要是由線粒體途徑介導(dǎo)的,在凋亡誘導(dǎo)因素作用下,線粒體可釋放促凋亡(Smac),其可進(jìn)一步激活caspases程序 ,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Smac蛋白的發(fā)現(xiàn)完善并補(bǔ)充了線粒體為細(xì)胞凋亡調(diào)控中心的理論[2,3]。丁苯酞是我國(guó)第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的化學(xué)藥物,其多種抗缺血機(jī)制受到廣泛重視。本實(shí)驗(yàn)采用不同方法觀察丁苯酞對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后Smac蛋白表達(dá)的影響,旨在探討其抗神經(jīng)元凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防組、丁苯酞預(yù)防加治療組,每組36只,各實(shí)驗(yàn)組又分為缺血再灌注6 h、12 h、24 h 3個(gè)亞組。

1.2 主要試劑及儀器 丁苯酞膠囊:石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字08100111,用 tween 80溶液稀釋,給藥計(jì)量為80 mg/kg;兔抗大鼠Smac多克隆抗體,Smac(H-177):北京中杉生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL):北京中杉生物技術(shù)有限公司;BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。

1.3 動(dòng)物模型制備及給藥 動(dòng)物模型制備參照Z(yǔ)ea Longa法加以改良制作,假手術(shù)組魚線置入頸內(nèi)動(dòng)脈10 mm即可,余步驟同模型組。各組均在術(shù)后1 h～2 h大鼠清醒時(shí)行神經(jīng)功能評(píng)分,其標(biāo)準(zhǔn)參照Berderson 5分制法進(jìn)行,1分～3分判定為造模成功,0分、4分或死亡剔除,再隨機(jī)補(bǔ)充。造模成功的大鼠分別于再灌注6 h、12 h、24 h后麻醉,斷頭取腦,去除腦干和小腦,于固定液中固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋待用。

給藥,假手術(shù)組及缺血再灌注組采用缺血1 h后腹腔注射同體積生理鹽水;丁苯酞治療組于缺血1 h后腹腔注射丁苯酞稀釋液;預(yù)防組采用手術(shù)前一周連續(xù)灌胃給藥,每日2次,手術(shù)當(dāng)天不給藥;預(yù)防加治療組采用術(shù)前一周連續(xù)灌胃給藥,缺血1 h后腹腔注射給藥1次。

1.4 免疫組化測(cè)Smac蛋白 取厚約 3 μ m的冠狀切片,常規(guī)脫蠟脫水,經(jīng)H2O2及蒸餾水浸泡后PBS洗滌,滴加一抗100 μ L,4℃冰箱過(guò)夜,次日取出室溫放置30 min后PBS洗滌,滴加二 抗100μ L,37℃烤箱置20min后洗滌 ,DAB顯色 。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),測(cè)量Smac蛋白染色陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。

1.5 TUNEL法測(cè)凋亡細(xì)胞 將凋亡檢測(cè)試劑盒中試劑1與2配成T UNEL反應(yīng)混合物,計(jì)數(shù)T UNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western檢測(cè)蛋白水平 取組織100 mg,加入蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解緩沖液),勻漿,離心后取上清加入等體積的2×SDS buffer,煮沸5min,迅速冰浴,離心后取上清備用,SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育:大鼠來(lái)源 Smac和beta-actin用TBST以1∶1 000稀釋,4℃過(guò)夜;二抗孵育:二抗以 1∶1 000稀釋,室溫孵育 2 h;ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色,掃描,進(jìn)行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色觀察病理改變 假手術(shù)組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞密度大,缺血再灌注組缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)較疏松,間質(zhì)水腫,有散在空腔形成,且出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性、壞死,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少,胞核形態(tài)不規(guī)則,輪廓模糊。治療組、預(yù)防加治療組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常,病理改變輕微,海馬區(qū)可見(jiàn)錐體細(xì)胞。

2.2 免疫組化結(jié)果 假手術(shù)組中Smac蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá),缺血再灌注組于再灌注6 h后Smac蛋白已經(jīng)開始表達(dá),再灌注24 h表達(dá)量最高,陽(yáng)性細(xì)胞于胞漿胞核都著色,染色呈棕黃色顆粒,廣泛表達(dá)于大腦皮層和海馬。丁苯酞治療組、預(yù)防加治療組各時(shí)間點(diǎn)Smac蛋白表達(dá)較缺血再灌注組弱。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠腦缺血再灌注后Smac蛋白表達(dá)圖像分析的灰度值(±s)

表1 大鼠腦缺血再灌注后Smac蛋白表達(dá)圖像分析的灰度值(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 12 179.96±2.051) 179.81±2.681) 179.85±2.511)模型組 12 153.05±1.10 143.57±1.92 139.60±2.20治療組 12 169.08±1.681) 167.69±1.671) 157.02±2.001)預(yù)防組 12 153.98±2.11 144.01±2.95 139.73±3.12預(yù)防加治療組 12 175.74±2.361)2) 175.46±1.471)2) 166.27±2.001)2)與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較,1)P＜0.05;與治療組同時(shí)間點(diǎn)比較,2)P＜0.05

2.3 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組凋亡細(xì)胞偶可見(jiàn);缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)在大腦皮層和海馬區(qū)凋亡細(xì)胞表達(dá)較多,表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮,內(nèi)散在棕黃色顆粒。其中以缺血再灌注24 h凋亡細(xì)胞表達(dá)最多;丁苯酞治療組、預(yù)防加治療組凋亡細(xì)胞數(shù)較少。詳見(jiàn)表2。

表2 大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡數(shù)(±s)個(gè)/400倍視野

表2 大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡數(shù)(±s)個(gè)/400倍視野

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術(shù)組 12 3.08±1.001) 3.67±0.991) 4.50±1.781)模型組 12 26.58±2.64 27.00±2.89 27.33±3.73治療組 12 17.17±2.731) 17.33±2.311) 17.33±2.841)預(yù)防組 12 24.00±1.60 26.67±2.35 26.67±3.26預(yù)防加治療組 12 13.58±1.931)2) 13.58±1.981)2) 14.00±2.801)2)與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較,1)P＜0.05;與治療組同時(shí)間點(diǎn)比較,2)P＜0.05

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果 以 Smac蛋白/β-actin作為比較指標(biāo),提示假手術(shù)組中僅有少量Smac蛋白,缺血再灌注組Smac蛋白含量顯著增多,其與β-actin的比值大于1,治療組與預(yù)防加治療組中的Smac蛋白含量較缺血再灌注組明顯減少。詳見(jiàn)表3。

表3 Western bolt檢測(cè)Smac蛋白/β-actin結(jié)果(±s)

表3 Western bolt檢測(cè)Smac蛋白/β-actin結(jié)果(±s)

組別 n 再灌注后24 h假手術(shù)組 36 0.825±0.0151)模型組 36 1.218±0.018治療組 36 0.964±0.0231)預(yù)防組 36 1.212±0.027預(yù)防加治療組 36 0.931±0.0121)2)與模型組比較,1)P＜0.05;與治療組比較,2)P＜0.05

3 討 論

近來(lái)研究表明在缺血缺氧所致的神經(jīng)元凋亡機(jī)制中,線粒體通路起主導(dǎo)作用,凋亡刺激引起線粒體膜通透性變化,可誘導(dǎo)其釋放一種促凋亡蛋白-Smac[4,5]。XIAP是IAPs蛋白酶家族中普遍存在的內(nèi)源性凋亡蛋白抑制劑,其抑制Caspases活性作用能被多種基因負(fù)性調(diào)控,Smac是其中之一,因其可直接與IAP結(jié)合,故又命名為低等電點(diǎn)的IAP直接結(jié)合蛋白。正常情況下Smac位于線粒體內(nèi)膜腔,當(dāng)線粒體受到凋亡信號(hào)刺激膜孔開放即移位到胞漿與XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合解除其對(duì)Caspase-9的抑制,與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合則解除其對(duì)Caspase-3的抑制[6],而且Smac還可通過(guò)與胞質(zhì)內(nèi)的Apaf-1形成凋亡復(fù)合體、與效應(yīng)Caspases相互作用等多種途徑增加細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性,這均是Smac蛋白促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡造成繼發(fā)性腦損傷的原因。

丁苯酞與南方水芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的結(jié)構(gòu)相似,動(dòng)物藥效學(xué)研究提示,其可阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個(gè)環(huán)節(jié),具有較強(qiáng)的抗缺血作用,可明顯縮小大鼠局部腦缺血的梗死面積,減輕腦水腫,改善腦能量代謝和缺血區(qū)的微循環(huán)和血流量。

本實(shí)驗(yàn)研究了Smac蛋白在腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)及丁苯酞對(duì)其的影響,觀察到腦缺血再灌注損傷6 h后胞漿中Smac蛋白的免疫陽(yáng)性細(xì)胞增多,24 h表達(dá)最多,并且胞漿和胞核都著色[7],提示Smac蛋白可能參與了腦缺血損傷的病理過(guò)程。丁苯酞治療組、預(yù)防加治療組各時(shí)間點(diǎn)Smac蛋白的表達(dá)均較缺血再灌注組低,提示丁苯酞可能通過(guò)下調(diào)Smac蛋白的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。丁苯酞提前預(yù)防組陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)同模型組比較尚不能認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而丁苯酞預(yù)防加治療組中陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)卻明顯低于治療組,因此丁苯酞預(yù)防腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制尚待研究。

[1]曲友直,高國(guó)棟.川芎嗪及其聯(lián)合用藥治療腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床康復(fù),2004,8(19):3862-3863.

[2]Nakka VP,Gusain A,M ehta SL,et al.Molecular mechanisms of apoptosis in cerebral ischemia:Multiple neuroprotective opportunities[J].Molecular Neurobiology,2008,37(1):7-38.

[3]G reen DR.Apoptotic pathways:Paper wraps stone blunts scissors[J].Cell,2000,102(1):1-4.

[4]Worf BB,Green DR.Suicidal tendencies:Apoptotic cell death by caspase-family proteinase[J].J Biol Chem,1999,274(29):20049-20052.

[5]Du C,Fang M,Li Y,et al.Smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-Dependent caspase activations by eliminating IAP inhibition[J].Cell,2000,102(1):33-42.

[6]Srinivasula SM,Hegde R,Saleh A,et al.A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulates caspase activity and apoptosis[J].Nature,2001,410(6824):112-116.

[7]曹立梅,畢桂南,羅傳明,等.腦缺血再灌注后 XIAP與Smac表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2006,23(6):669-671.