王 芳,劉榮臻,劉志偉

腦梗死(infarction cerebral,CI)是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而引起的常見疾病,近年來呈年輕化趨勢,其高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率嚴(yán)重危害中老年人的健康。E-選擇素(E-selectin)作為重要的炎癥細(xì)胞因子,它與高血壓,血脂代謝異常、動脈粥樣硬化的形成等腦梗死高危因素之間關(guān)系密切。本研究通過檢測山西漢族腦梗死患者血漿E-selectin水平及基因S128R多態(tài)性,探討其與腦梗死之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例組腦梗死患者來自2008年11月—2009年2月山西省汾陽醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診、住院患者73例,男40例,女33例,年齡(60.11±11.48)歲。診斷符合全國第四屆腦血管會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],均經(jīng)頭顱CT或M RI確診,排除冠心病、感染性疾病、糖尿病、肝腎功能衰竭等引起的患者,同時剔除近期服用降脂、激素藥物的患者;合并高血壓35例,高脂血癥23例,無并發(fā)癥15例。

對照組85名,男49名,女 36名,年齡(60.74±10.05)歲,為同期來本院進(jìn)行健康體檢者,無腦梗死、腦出血、糖尿病、高血壓、高血脂、肝、腎等自身免疫性疾病病史。全部試驗(yàn)對象均長期居住于山西省、無血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的收集 病例組于發(fā)病24 h內(nèi)抽取清晨空腹靜脈血4 mL,3 000 r/min離心5 min,分離血漿和血細(xì)胞,-80℃低溫冰箱保存;對照組做同樣處理。

1.2.2 試驗(yàn)方法 ELISA法測定各組血漿E-選擇素水平,血液基因組DNA提取試劑離心柱型(天根生物技術(shù)公司)抽提DNA,PCR-RFPL法進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對引物[2],上游引物:5'-AGTAA TAGTCCTCCTCATCATG-3',下游引物:5'-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3'以特異性擴(kuò)增包含S128R位點(diǎn)的序列。

1.2.2.2 PCR 擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增 體系 25 μ L,模 板DNA 5 μ L,上下游引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)各20 pmoL,2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μ L(北京天根生物技術(shù)公司)。用熱循環(huán)儀94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,59℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)35次,最后72℃延伸 5 min。

1.2.2.3 限制性核酸內(nèi)切酶酶切 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ L,PstⅠ(M BI Fermentas)10 U,10×Buffer 2 μ L,雙蒸水 18 μ L。 37℃溫育箱孵育10 h。

1.2.2.4 電泳判斷基因型及測序 酶切產(chǎn)物加樣在含EB、濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳,電壓145V電泳50 min,紫外燈下拍照,經(jīng)凝膠成像與分析系統(tǒng)(JD801系列,中國江蘇)觀察電泳圖。對各基因型抽樣測序(北京天根生物技術(shù)公司)。

1.2.3 血漿E-選擇素含量測定 所有標(biāo)本用E-selectin ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)檢測,試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。酶標(biāo)儀(BIO-RAD MODEL680,USA)490 nm處測OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件包分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算,單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn),并以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示相對風(fēng)險(xiǎn)度。血漿E-選擇素水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用 t檢驗(yàn),方差分析,組間用Bonferroni法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 血漿E-selectin水平 與對照組相比,腦梗死組血漿E-selectin水平明顯升高(t=13.139,P＜0.05);與腦梗死無并發(fā)癥組相比,合并高血壓、高脂血癥患者的血漿E-selectin水平也顯著升高(P＜0.05),而并發(fā)高血壓組和并發(fā)高脂血癥組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1、表2。

表1 對照組與腦梗死組血漿E-選擇素濃度比較(±s)

表1 對照組與腦梗死組血漿E-選擇素濃度比較(±s)

組別 n E-selectin(ng/mL)對照組 85 13.80±5.37腦梗死組 73 44.62±19.411)與對照組相比,1)P＜0.05

表2 腦梗死各組間血漿E-選擇素濃度比較(±s)

表2 腦梗死各組間血漿E-選擇素濃度比較(±s)

項(xiàng)目 n E-selectin(ng/mL)無并發(fā)癥組 15 27.54±10.54并發(fā)高血壓組 35 46.56±21.521)并發(fā)高脂血癥組 23 52.80±13.121)與并發(fā)癥組相比,1)P＜0.05

2.2 E-選擇素基因S128R多態(tài)性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小186bp,根據(jù)限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切片段的情況,基因型有3種,正常純合子 SS型(63bp,123bp兩條帶),雜合子 SR型(63bp,123bp,186bp三條帶),突變純合子RR型(186bp一條帶);為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果,應(yīng)用DNA基因測序進(jìn)行驗(yàn)證評實(shí)了這一結(jié)果。

2.3 E-選擇素基因型在兩組人群中分布頻率 經(jīng) Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn),達(dá)到遺傳平衡,具有群體代表性。經(jīng)χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析,基因型、等位基因在腦梗死組和對照組的分布,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相對風(fēng)險(xiǎn)度分析,攜帶等位基因R患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)性是S的4.985倍(OR=4.985,95%CI:1.543～15.928)。詳見表3。

表3 腦梗死組和對照組基因S128R多態(tài)性分析 例(%)

3 討 論

動脈粥樣硬化(AS)是腦梗死的高危因素之一,最近研究表明,AS可能是一種慢性炎癥狀態(tài),且炎癥反應(yīng)貫穿了從脂紋形成到斑塊破裂的全過程。E-選擇素即人類白細(xì)胞分化抗原CD62E,由活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,是唯一僅限于內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的誘導(dǎo)性黏附分子,屬于選擇素家族(SF);它介導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的起始黏附,并錨定白細(xì)胞,繼而介導(dǎo)白細(xì)胞活化,使白細(xì)胞在損傷區(qū)域滾動,引起一系列炎癥反應(yīng),導(dǎo)致AS的形成[3]。在CD18、CD62E基因共同敲除的小鼠,表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)缺陷,白細(xì)胞的黏附率下降了95%,證明E-選擇素在炎癥反應(yīng)中的作用不能被其他黏附因子所替代[4]。研究還發(fā)現(xiàn),E-selectin與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[5],而粥樣斑塊的不穩(wěn)定性與腦梗死的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。因此,E-selectin與腦梗死的相關(guān)性研究成為目前的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,腦梗死組血漿E-selectin濃度明顯升高(P＜0.05),提示血漿E-selectin水平與腦梗死的發(fā)生有關(guān),與Blann等[6]的報(bào)道一致。在腦梗死組,合并高血壓、高脂血癥的患者與無并發(fā)癥組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),可能是由于高血壓和高血脂引起內(nèi)皮損傷、功能失調(diào),導(dǎo)致血管通透性增加,使活化的內(nèi)皮表達(dá)大量的E-selectin所致;雖然高血壓組和高脂血癥組比較有一定的差異,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

分子遺傳學(xué)的研究表明,人E-selectin基因位于第1號染色體長臂上,為一段長13kb的DNA序列,含14個外顯子和13個內(nèi)含子;證實(shí)E-selectin基因第4外顯子區(qū)128位點(diǎn)存在S/R多態(tài)性,這種基因多態(tài)性的存在可能影響E-selectin基因表達(dá)水平及生物學(xué)功能[2]。有研究證明E-selectin基因S128R多態(tài)性與多種疾病的易感性存在相關(guān)性,如冠心病[7]、心肌梗死[8]等,但是其否與腦梗死相關(guān),國內(nèi)外報(bào)道較少。

1994年德國學(xué)者Wenzel等[8]首先證實(shí) E-選擇素基因第561位堿基因腺嘌呤(A)/(C)(A561C)的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致其分子128為氨基酸由絲氨酸(Ser)變成精氨酸(Arg)(S128R),而且A561C(S128R)的多態(tài)性與德國白種人早發(fā)的動脈粥樣硬化有關(guān)。韋葉生等[9,10]報(bào)道E-selectin基因S128R多態(tài)性在廣西壯族、漢族兩民族差異有顯著性,同時發(fā)現(xiàn)廣西壯族人基因S128R多態(tài)性與IS存在相關(guān)性,等位基因R可能是廣西壯族人IS發(fā)病的遺傳易感基因。本研究結(jié)果顯示,E-selectin基因S128R多態(tài)性在山西漢族人群腦梗死組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相對風(fēng)險(xiǎn)度分析,攜帶R等位基因患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)是S等位基因的4.958倍,說明E-selectin基因S128R多態(tài)性與山西漢族腦梗死易患性有關(guān),R可能是山西漢族人腦梗死發(fā)病的易感因素。

腦梗死呈遺傳易感性與環(huán)境因素相結(jié)合的發(fā)病模式,外界因素雖然可使發(fā)病率增高,但最終仍需通過遺傳因素起作用。E-selectin基因多態(tài)性與腦梗死的研究尚處于起始階段,由于存在種族、地域和個體差異問題,還需多樣本、多地域進(jìn)行深入的探討,將有可能為腦梗死高危人群的篩查、早期診斷、干預(yù)和防治提供新的線索和一定指導(dǎo)意義。

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