李貴生，趙振云，翁少萍，梁寵榮，梁志鋒

(1. 暨南大學(xué)生物工程學(xué)系，廣東 廣州 510632;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)院，廣東 廣州 510275)

全球龜鱉類動(dòng)物約有13科、89屬、270余種[1]，烏龜Chinemysreevesii隸屬于龜鱉目Testudinata曲頸龜亞目Cryptodira淡水龜科Bataguridae烏龜屬Chinemys，在我國(guó)以及東南亞地區(qū)廣泛分布，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是目前我國(guó)龜類養(yǎng)殖的主要品種[2]，也是龜類研究的常用材料。 但是隨著養(yǎng)殖密度的不斷增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，近年來頻繁暴發(fā)的流行病使龜鱉養(yǎng)殖業(yè)損失慘重，特別是病毒病的流行缺乏有效的治療藥物，只能依賴于預(yù)防措施。組織培養(yǎng)技術(shù)可以為分離、鑒定病毒以及病毒在體外增殖提供理想的途徑，但目前未見烏龜細(xì)胞系建成的報(bào)道，甚至爬行類動(dòng)物的細(xì)胞系都普遍缺乏。離體培養(yǎng)的細(xì)胞可作為病毒體外擴(kuò)增的場(chǎng)所[3]，而且動(dòng)物病毒對(duì)細(xì)胞系的敏感性正如其對(duì)物種的敏感性一樣,具有一定的特異性[4]。國(guó)內(nèi)李正秋等[5]在2000年首次建立了中華鱉心組織穩(wěn)定生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞系(TSH)，培養(yǎng)至60余代。吳康等[6]進(jìn)行了中華鱉胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究；李曉莉等[7]采用組織塊移植培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)來源于中華鱉肝臟、脾臟、腎臟、心臟、皮膚及裙邊組織細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)。這些研究為中華鱉的病害防治打下了一定的基礎(chǔ)。烏龜細(xì)胞系的建立具有深遠(yuǎn)的科研意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的烏龜為3 ～ 6月齡，體質(zhì)量10 ～ 30 g， 取自暨南大學(xué)爬行動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng).

1.2 組織培養(yǎng)材料

試驗(yàn)用國(guó)產(chǎn)24孔培養(yǎng)板，進(jìn)口一次性塑料培養(yǎng)瓶。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。所有培養(yǎng)液的pH值都調(diào)整到7.20。實(shí)驗(yàn)在紫外線殺菌1 h以上的無菌室進(jìn)行。

1.3 組織細(xì)胞原代培養(yǎng)

將幼齡烏龜體表清洗干凈，消毒和麻醉后放入玻璃平皿，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，將烏龜頭骨和甲橋打開，分別取出其腦部組織、肝臟、脾臟、腎、心臟和尾部肌肉等，放入不同的平皿中，用PBS浸泡。

腦部組織用含有雙抗的PBS漂洗，剔除軟骨組織并剪成塊，再用PBS漂洗多次后吸去多余液體。 其他臟器組織用含有400萬單位/mL雙抗的PBS漂洗。 各組織小塊集中于平皿一角，用眼科剪不斷反復(fù)剪切組織塊約20 ～ 30 min，約剪成1 mm3大小。 剪好的腦部組織塊無需經(jīng)胰酶消化，直接加入約2 mL含有雙抗的φ=20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用移液器移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)使瓶?jī)?nèi)液體鋪滿底面，做好標(biāo)記，放入27 ℃ 恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 ～ 5 d組織塊貼壁后補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。 其他臟器組織以被消化物5 ～ 10倍體積的w=0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液消化組織，對(duì)于較大的組織塊可在消化時(shí)繼續(xù)剪切。 消化完全后，加入含有φ=20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打數(shù)次，以400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾數(shù)次，吸入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上層消化液，加入5 mL新鮮含有雙抗和φ=10% 血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接入25 cm2培養(yǎng)瓶，作好標(biāo)記，放入27 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)過程中，隨時(shí)觀察細(xì)胞的貼壁以及生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)初期隔3 ～ 5 d更換半量的培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)有污染的培養(yǎng)瓶要及時(shí)丟棄。

1.4 原代細(xì)胞傳代

吸去原瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加1 mL含有EDTA的胰蛋白酶消化液，傾斜培養(yǎng)瓶使消化液覆蓋細(xì)胞面，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化變化并計(jì)時(shí)，當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞變成圓球形和細(xì)胞間隙增大現(xiàn)象時(shí)，加入2 mL含有血清的培養(yǎng)液終止消化。 然后用吸管有序地吹打瓶壁細(xì)胞，將消化的細(xì)胞液移入離心管中，1 000 r/min，離心5 min后去除上層液體。 在離心管中加入10 mL含φ=20% 無抗生素的DMEM培養(yǎng)液，并反復(fù)吹吸以將細(xì)胞團(tuán)充分打散。 將10 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液分裝于兩個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶中，作好細(xì)胞類別、代數(shù)和日期標(biāo)記，放入27 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 腦細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取第5代傳代細(xì)胞，用常規(guī)胰酶消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種到48孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后換液，隔24 h隨機(jī)完全消化3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，取其均值。 連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，然后繪制曲線。

1.6 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

用φ=20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成含有φ=10% DMSO的凍存液，待細(xì)胞相對(duì)密度長(zhǎng)至1×106以上時(shí)，將單層細(xì)胞培養(yǎng)物按照細(xì)胞傳代的方法，經(jīng)胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心3 min去上清。 加入φ=10% DMSO凍存液并分散細(xì)胞。 細(xì)胞懸液分裝在2 mL凍存管中，每管1 ～ 1.5 mL。 旋緊凍存管，做好凍存標(biāo)記，放入凍存盒中，-70 ℃ 過夜后投入液氮罐中。

從液氮中取出需要復(fù)蘇的凍存管，迅速投入43 ℃ 水浴中，不斷振蕩使其快速融化約1 min。 室溫下5 min內(nèi)，用25 ℃ 左右的φ=20% 胎牛血清培養(yǎng)液稀釋至原體積的4倍，于15 mL離心管中800 r/min，離心3 min，然后去掉上清，加入新鮮培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

2.1 腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)結(jié)果

烏龜腦部組織培養(yǎng)至2 ～ 3 d開始貼壁。 5 d后可見組織塊周圍有細(xì)胞遷出，遷出細(xì)胞有神經(jīng)突起伸長(zhǎng)并逐漸增多。 烏龜腦細(xì)胞(TBCs)生長(zhǎng)10 d后可見遷出范圍逐漸擴(kuò)大，形成生長(zhǎng)暈，細(xì)胞呈扁平三角形，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央(圖1A)。 此后細(xì)胞逐漸向組織塊外擴(kuò)展，經(jīng)2 周左右，各生長(zhǎng)暈聯(lián)合成片(圖1B，圖1C)。 原代細(xì)胞培養(yǎng)需要較長(zhǎng)時(shí)間，待細(xì)胞90% 鋪滿培養(yǎng)瓶底即可進(jìn)行首次傳代。

圖1 腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)

2.2 腦細(xì)胞的傳代結(jié)果

TBCs首次傳代貼壁后觀察，可清晰地看到多極的細(xì)胞，伸出較多且粗的突起。 第2代(TBCs-2)培養(yǎng)1周后，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的85%以上，細(xì)胞密集。 從第3代(TBCs-3)開始，培養(yǎng)瓶中突起逐漸消失，細(xì)胞增殖旺盛。 第4代(TBCs-4)和第5代(TBCs-5)細(xì)胞出現(xiàn)聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象，且在TBCs-5細(xì)胞生長(zhǎng)后期，在細(xì)胞群中出現(xiàn)了細(xì)胞體積較小的“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞(圖2A)。 第6代(TBCs-6)部分培養(yǎng)瓶中形成了明顯的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛(圖2B)，而原來的細(xì)胞停止生長(zhǎng)。 由第7代(TBCs-7)開始，“轉(zhuǎn)化”后的細(xì)胞大量增殖，形成明顯的“轉(zhuǎn)化灶”。 “轉(zhuǎn)化灶” 周圍細(xì)胞明顯空泡化(圖2C)，并逐漸崩解，培養(yǎng)液中細(xì)胞碎片和分泌物增多。 第8代(TBCs-8)中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，原來的細(xì)胞繼續(xù)死亡。 至第9代(TBCs-9)時(shí)， 轉(zhuǎn)化后細(xì)胞取代原來細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶完全被轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞占據(jù)。 培養(yǎng)至第10代(TBCs-10)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈多邊形(圖2D)。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)均一出現(xiàn)在第12代(TBCs-12)。

圖2 腦細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2.3 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的TBCs-4細(xì)胞凍存，8周后進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇，4 h換液后觀察，TBCs-5已經(jīng)大部分貼壁，細(xì)胞呈多角形，有突起。 復(fù)蘇1 d后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，已經(jīng)鋪滿培養(yǎng)瓶底80%。 復(fù)蘇后3 d，TBCs-5開始聚集生長(zhǎng)。 至1 周時(shí)，細(xì)胞聚集呈放射狀，生長(zhǎng)停止。

2.4 其他臟器組織的體外培養(yǎng)

肝組織細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化并用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后較難貼壁，培養(yǎng)2 ～ 3 d觀察，大部分細(xì)胞仍未貼壁，呈大小相似的圓球形。 培養(yǎng)至第9 天，細(xì)胞開始貼壁。 培養(yǎng)至第11天，細(xì)胞開始生長(zhǎng)，多呈梭狀結(jié)構(gòu)。 培養(yǎng)2周時(shí)，梭狀細(xì)胞迅速增加，匯合成片。 第16天時(shí)培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)典型的多邊形細(xì)胞，符合肝細(xì)胞特征，高倍鏡下可清楚地看到細(xì)胞核和核仁，且細(xì)胞中存在顆粒結(jié)構(gòu)。 培養(yǎng)第17天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合成片。 培養(yǎng)第18 天，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。

傳代后的烏龜肝臟細(xì)胞(TLCs)培養(yǎng)瓶中雜細(xì)胞增多。 至第3代(TLCs-3)，培養(yǎng)瓶中非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增多，原有的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)開始下降。 傳至第4代(TLCs-4)時(shí)，細(xì)胞成片浮起，剩余的貼壁細(xì)胞內(nèi)空泡增多，細(xì)胞折光性降低。

分離培養(yǎng)的烏龜腎臟細(xì)胞2 d后即可見貼壁，但細(xì)胞不見生長(zhǎng)。 培養(yǎng)至第9 天，細(xì)胞呈梭狀，無明顯增殖。 10 d左右原有的細(xì)胞出現(xiàn)死亡。

3 討 論

迄今為止，未見有關(guān)烏龜腦組織細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)取材于幼年的烏龜腦部組織，由于幼年烏龜?shù)捏w型小，其腦部組織難以大量獲得，機(jī)械法和常規(guī)的胰酶配合細(xì)胞篩網(wǎng)的消化法容易造成細(xì)胞的損失，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)烏龜?shù)哪X細(xì)胞采用了傳統(tǒng)的組織塊移植培養(yǎng)法。 我們也曾嘗試使用胰酶消化法培養(yǎng)烏龜腦細(xì)胞，結(jié)果采用組織塊培養(yǎng)法更容易貼壁成功。 關(guān)于培養(yǎng)體系，目前我們主要使用高糖的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，我們對(duì)比了高糖DMEM和RPMI1640兩種培養(yǎng)液在烏龜細(xì)胞體外培養(yǎng)中的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖的DMEM更加適合烏龜細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

在腦細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中，當(dāng)培養(yǎng)至第5代時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老。 第5代后期，在大量空泡化的衰老細(xì)胞中出現(xiàn)了形態(tài)同原代細(xì)胞明顯不同的細(xì)胞群體，這種上皮樣細(xì)胞個(gè)體小于原代腦細(xì)胞，在原代細(xì)胞出現(xiàn)普遍衰老的時(shí)候，其生長(zhǎng)狀態(tài)反而更好。 鏡檢可見細(xì)胞均質(zhì)、明亮、透明度大、折光性好。 我們認(rèn)為這種現(xiàn)象是細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontenous Transformation)。 體外培養(yǎng)的細(xì)胞，受到致突變作用時(shí)可發(fā)生轉(zhuǎn)化。Reynolds等[9]在培養(yǎng)胚胎紋狀體細(xì)胞時(shí)用神經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)一種前體細(xì)胞增殖分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。這類細(xì)胞具有自我分裂、自我復(fù)制、自我更新及自我維持的能力，并具有多向分化潛能。其作用類似于造血系統(tǒng)的干細(xì)胞，被命名為神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells ，NSCs)。NSCs不僅存在于發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)，而且存在于包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物的成熟神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，包括腦室區(qū)、海馬、脊髓、皮層和中腦均已分離培養(yǎng)出NSCs[10]。本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是否為NSCs，有待進(jìn)一步研究。

肝臟是動(dòng)物在正常生理和病理狀態(tài)下進(jìn)行能量代謝、毒素的生物轉(zhuǎn)化以及血漿蛋白合成的中心器官。離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞是一種可以精確模仿體內(nèi)肝臟活動(dòng)的簡(jiǎn)單系統(tǒng)[11]。 目前肝細(xì)胞的培養(yǎng)大多處于原代培養(yǎng)階段，傳代培養(yǎng)較少報(bào)道，有待進(jìn)一步開展。本研究結(jié)果表明，烏龜肝細(xì)胞在原代培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)良好，但傳代培養(yǎng)至第3代，烏龜肝細(xì)胞開始出現(xiàn)退化現(xiàn)象，至第4代細(xì)胞開始大量死亡，無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。 此外，本實(shí)驗(yàn)還嘗試分離培養(yǎng)烏龜?shù)男募?、脾臟、尾部肌肉以及腎臟細(xì)胞，結(jié)果均不理想。

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