張 霖 陳育堯 孫學(xué)剛 呂志平 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 (廣州 510515)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,N AFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致,以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主的病理綜合征,隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展,N AFLD患病率迅速增高,現(xiàn)已成為危害人類健康的三大肝病之一,其與胰島素抵抗及其相關(guān)的代謝綜合征和遺傳易感性密切相關(guān)[1],臨床尚無理想的治療藥物。中藥虎杖,苦、平,功能祛風(fēng)、利濕、破瘀、通經(jīng)[2]。古今醫(yī)家多利用虎杖單用或配伍治療脂肪肝,尤其對于濕熱型脅痛、黃疸?；⒄溶帐腔⒄鹊闹饕钚猿煞种?本文主要研究虎杖苷對非酒精性脂肪肝模型大鼠的保護(hù)作用,并從虎杖苷對 N AFLD模型大鼠胰島素抵抗(IR)的影響角度探討其可能作用機(jī)制。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 實驗動物:健康雄性 SD大鼠 44只,體重 200± 10g,SPF級,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號:0035578)。

1.1.2 藥物及試劑:虎杖苷(98.63%,HPLC,購自江蘇南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司),非諾貝特(國藥準(zhǔn)字H31021491,批號 070310,購自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院)。膽固醇購自廣州威佳生物科技有限公司,ELISA試劑盒購自廣東達(dá)暉生物科技有限公司,豬油購于廣州加益食品有限公司,大鼠基礎(chǔ)飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,高脂飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心加工生產(chǎn)。

1.2 方法 1.2.1 動物模型的建立和分組:健康雄性SD大鼠 44只,體重 200±10g,SPFA級,稱重后分籠喂養(yǎng),每籠 4只,標(biāo)號,飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心。正常喂養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為 2組 ,正常組 (A)和模型組 (M),正常組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料,模型組給予高脂飼料(高脂飼料配制:10%豬油+2%膽固醇+88%標(biāo)準(zhǔn)飼料)喂養(yǎng),8周后,分別從正常組和模型組隨機(jī)挑選一只,取肝臟做病理切片,證實非酒精性脂肪肝形成。再將模型組隨機(jī)分為 5組:空白模型組(B)、虎杖苷高劑量組 (C1)、虎杖苷中劑量組(C2)、虎杖苷低劑量組(C3)、非諾貝特組(D),每組 7只,組間大鼠體重差異無顯著性 (P＞0.05)。正常對照組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),其余高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)期間,實驗動物自由飲水和進(jìn)食,動物房保持安靜,自然采光,溫度 25℃左右。喂養(yǎng)持續(xù) 8周。

1.2.2 給藥:8周后,A組、B組予以生理鹽水灌胃,5mL/次 ,C1、 C2、 C3分別 以 160mg/kg.d、80 mg/kg.d、 40 mg/kg.d虎杖苷混懸液灌胃,D組以 100mg/kg.d非諾貝特混懸液灌胃。持續(xù) 4周。

1.2.3 標(biāo)本采集:從造模開始算,第 12周末當(dāng)晚大鼠禁食不禁水 12h,次日上午稱重后,用 10%水合氯醛以 0.35mL/100g濃度腹腔注射麻醉,腹主動脈取血 8mL,4℃,3000rmp離心 10min,分離血清。 -20℃保存。迅速提取肝臟,稱重,4℃生理鹽水沖洗,在肝右葉離邊緣 1cm處,橫切一塊肝組織用 10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋 ,HE染色。

1.2.4 指標(biāo)檢測:①肝臟大體性狀觀察,光鏡下病理切片觀察;②血脂、肝功能全自動生化分析儀分析;③空腹胰島素 (FN S):放免法測定,將樣本血清與抗血清混合反應(yīng),在加入標(biāo)記抗原進(jìn)行競爭性結(jié)合反應(yīng),反應(yīng)完全后,加入 PR免疫分離劑,分離出抗原抗體混合物,測定復(fù)合物的放射性(B),計算各標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率(B/B0%)。做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,查出樣品濃度;空腹血糖(FBG):采用酶法,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作;計算胰島素抵抗指數(shù) (IRI)= FBG×FN S/22.5,胰島素敏感指數(shù) (ISI)=1/(FBG×FNS);

2 結(jié) 果

2.1 肝臟大體性狀觀察 正常組大鼠肝臟包膜光滑完整,表面顏色暗紅 ,光潤,中等硬度,邊緣銳利,切面細(xì)顆粒感,無油膩感。模型組大鼠肝臟均表面發(fā)黃,肝臟體積明顯增大,包膜緊張?；⒄溶战M肝臟較正常組偏大,但比模型組明顯減小,大部分顏色暗紅、潤澤,切面無油膩感。中小劑量組肝臟普遍增大,色淡黃,切面油膩感。非諾貝特組體積稍增大,色暗紅,部分切面油膩感。

2.2 肝臟病理觀察(見附圖)正常組肝細(xì)胞肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀分布,胞漿呈均勻一致的紅染狀態(tài),肝竇清晰可見,肝索排列整齊。模型組肝細(xì)胞腫脹,部分肝細(xì)胞呈氣球樣變。多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等,數(shù)量不一的脂滴空泡,肝索排列紊亂?；⒄溶战M有顯著的改善,其脂肪滴與模型組明顯減少,密度稀,肝竇清晰,肝索排列整齊 ,無炎性細(xì)胞浸潤。非諾貝特組明顯脂肪變性,脂肪滴膠模型組小,密度稍稀,肝細(xì)胞腫脹,排列不整齊。

2.3 各組大鼠 ALT、AST比較 模型組大鼠 ALT高于正常組(P=0.01),高劑量組顯著低于模型組(P=0.007),且與非諾貝特組存在顯著差異(P=0.034),中劑量組低于模型組(P=0.031),非諾貝特組與模型組無差異(P=0.569),見表 1。

表1 虎杖苷對各組大鼠肝功能的影響(±s)

表1 虎杖苷對各組大鼠肝功能的影響(±s)

注:與正常組比較△P＜0.05,▲P＜0.01;◇ P＜0.05,◆P＜0.01與模型組比較;□ P＜0.05,■P＜0.01與西藥對照組比較。下列表注與此相同。

組 別 n ALT(U/L) AST(U/L)A 7 41.57± 6.106 113.00± 13.940 B 7 53.8± 12.061△ 139.57± 27.922 C1 7 40.86± 6.568◆□ 116.71± 17.792 C2 6 43.33± 5.785◇ 109.83± 19.843 C3 7 47.57± 6.425 115.57± 11.414 D 6 51.17± 11.268 134.83± 34.008

2.4 各組大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比較 模型組TG、TC、LDL-C、HDL-C與正常組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033,0.044,0.013,0.026),高劑量組與模型組 TG、TC、LDL-C、HDL-C差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00024,0.031,0.009,0.001),且在 TG方面與非諾貝特組存在顯著差異(P=0.002)。非諾貝特組在 TG、LDL-C、HDL-C方面與模型組存在顯著差異(P=0.003,0.029,0.0004)。 見表 2。

2.5 各組 FBG、FNS、IR、ISI比較 模型組 FBG、FNS、IR、ISI與正常組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000,0.002,0.001,0.000),高劑量組與模型組各項均存在顯著差異(P=0.000,0.000,0.001,0.000),與非諾貝特組比較在 FBG、IR、ISI方面有顯著差異(P=0.000,0.000,0.001)。見表 3。

表2 虎杖苷對各組大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比較(±s)

表2 虎杖苷對各組大鼠 T G、TC、LDL-C、HDL-C比較(±s)

組 別 n TG(mmol/L) TC(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-L(mmol/L)A 7 0.597± 0.111 0.863± 0.080 0.414± 0.041 0.437± 0.042 B 7 0.754± 0.093△ 1.094± 0.422△ 0.491± 0.056△ 0.351± 0.052△C1 7 0.464± 0.162◆ 0.844± 0.124◇▲ 0.410± 0.033## 0.487± 0.052◆C2 6 0.522± 0.195◇ 0.933± 0.122 0.438± 0.062 0.440± 0.078◇C3 7 0.623± 0.117 0.947± 0.125 0.514± 0.054 0.367± 0.051 D 6 0.523± 0.087◆ 1.238±0.136 0.422±0.078◇ 0.502± 0.120◆

表3 虎杖苷對各組大鼠胰島素抵抗的影響(±s)

表3 虎杖苷對各組大鼠胰島素抵抗的影響(±s)

組 別 n FBG(mmol/L) FIN(Uiu/mL) IR ISI A 7 4.814± 1.300 7.871± 0.622 1.674± 0.418 0.028± 0.005 B 7 11.857± 1.875▲ 12.097± 1.498▲ 6.406± 1.403▲ 0.007± 0.002▲C1 7 4.057± 0.597◆■ 8.780± 1.112◆ 1.579± 0.290◆■ 0.029± 0.005◆■C2 6 8.350± 0.622◆ 9.697± 0.881◇ 3.591± 0.352◇ 0.012± 0.001◇C3 7 10.357± 0.720 11.724± 1.462 5.408± 0.841 0.008± 0.001 D 6 8.833± 0.731◆ 10.077± 0.773◇ 3.954±0.411◇ 0.011± 0.001◇

討 論 近年來的研究發(fā)現(xiàn),在正常體重、糖耐量、血脂的人群中也可發(fā)生 N AFLD,但通過高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗等方法發(fā)現(xiàn) N AFLD患者幾乎都存在 IR,提示 NAFLD與 IR之間存在明顯的相關(guān)性。

N AFLA多由過食肥甘厚味,導(dǎo)致濕熱蘊(yùn)藉中焦,臨床以脅痛、黃疸、肥胖、舌苔厚膩 ,脈弦滑為特征,屬中醫(yī) “脅痛”、“肥胖”、“黃疸”等范疇。中藥虎杖,苦、平,功能利濕退黃、破瘀,是臨床治療“脅痛”、“肥胖”、“黃疸”的常用藥物。本實驗表明,虎杖苷作為虎杖的其中一種重要活性成分,能降低模型大鼠血脂水平,改善肝功能,保護(hù)肝細(xì)胞。機(jī)制研究表明虎杖苷能顯著改善模型大鼠體內(nèi)胰島素抵抗。由此推測虎杖苷可能通過改善胰島素抵抗 ,增加大鼠體內(nèi)對胰島素的敏感性,減少脂肪動員,減輕或解除肝細(xì)胞氧化超載,從而降低血脂、改善肝功能,保護(hù)肝細(xì)胞,從而達(dá)到治療非酒精性脂肪肝的作用?；⒄溶赵诨⒄雀康暮扛哌_(dá) 1.231%,且提取分離簡單,隨著藥效和作用靶點的明確,具有很廣闊的開發(fā)前景。我們將進(jìn)一步深入研究虎杖苷改善 IR狀態(tài)的分子機(jī)制,并從多角度研究其治療 NAFLD的機(jī)制,為從中草藥中開發(fā)治療 N AFLD的藥物尋找科學(xué)依據(jù)。

[1] Seung HP,Byung IK,Sang HK,et al.Body fat distribution and insulin resistance: beyond obesity in nonalcoholic fattyliver disease amongoverweight men in American College of Nut rition,2007,26(4):321-3261.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典 [M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2005:1329.