張晨芳 張宏斌 寇曉梅 康慧鑫 柯永利 李 芬 李 燕

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院普通外科(廣州 510010)

黃花蒿(Artemisia annua L.)別名青蒿,菊科艾屬一年生草本植物,為我國傳統(tǒng)中藥材,我國資源十分豐富。本研究主要是改變傳統(tǒng)的青蒿素制備工藝,通過發(fā)酵的方法制備出一種低毒的可以長期用來口服的新型的類似青蒿素的藥物,來抑制乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的活性,從而為黃花蒿酵解液對抗乳腺癌的藥用價值的進(jìn)一步開發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法 1.1 材料和試劑 M CF-7細(xì)胞由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科細(xì)胞室提供,黃花蒿原草產(chǎn)于西安,RPM I-1640培養(yǎng)液(吉諾生物公司),新生小牛血清(杭州四季青),M TS試劑 (PROM EGA公司),胰蛋白酶 (吉諾生物公司),0.2um過濾膜。

1.2 藥物制備 將糯米(1.5kg)浸泡后,蒸熟后冷水淋卻,使溫度降至 28～ 30℃,入大缸 ,搓散飯塊,拌入酒藥 (0.15kg),搭醅挖凹,凹底直徑約 15cm,飯面再薄薄撒一層酒藥,加蓋 ,保溫;經(jīng) 24～ 30h后出釀液,開動缸蓋 ,使缸內(nèi)溫度降下來,并可排出 CO2,供給 O2,促進(jìn)發(fā)酵;24h后釀塊浮起,按比例倒入冷水,切塊、翻轉(zhuǎn);48h后倒入米 (浸泡、蒸熟透后)3kg,黃花蒿葉末 40h,加曲 (0.05kg)拌勻,進(jìn)行前期發(fā)酵。過 12-18h后排除 CO2,72h后每缸倒入米飯 (浸泡、蒸熟透后 )2kg,黃花蒿葉末 3kg,加曲(0.02kg),拌缸 ;96h后,灌入小埕(每埕 3kg),液面距埕口約 10cm,扎好埕口,以利于在低溫、低氧下進(jìn)行主發(fā)酵(慢發(fā)酵)90d。取上清離心 3000r/min,30min,經(jīng) 0.2um過濾膜過濾除菌,得濃度為 200g/L的酵解液備用。

1.3 實驗方法 1.3.1 M CF-7細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)液為含 10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)液。將 25cm3培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃、飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng),待細(xì)胞數(shù)達(dá) 90%左右時,用 0.25%胰蛋白酶消化后傳代。實驗期間凍存細(xì)胞,實驗全過程均用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3.2 藥物處理后的分組情況:取對數(shù)生長期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后,細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為 5× 103個 /100uL培養(yǎng)液,接種于 96孔板中。于 5%CO2、37℃、飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后加入藥物。按黃花蒿酵解液終濃度分組,即黃花蒿酵解液 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L組,不同濃度培養(yǎng)相同時間 ,加入等量含 10%小牛血清的培養(yǎng)液組為對照組。

1.3.3 M TS法細(xì)胞增殖實驗:將 M CF-7細(xì)胞接種于 96孔板,每孔細(xì)胞數(shù) 5× 103個(分組同上 );細(xì)胞貼壁后 ,加入黃花蒿酵解液,使藥物終濃度為 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L,3個復(fù)孔 ,每板重復(fù) 3次 ,培養(yǎng) 48h。移液槍小心吸去所有上清夜,每孔加入 200ul無血清培養(yǎng)基及 40ulM TS,鋁箔包好培養(yǎng)板,培養(yǎng) 2h,酶標(biāo)儀 490nm波長測光密度(OD值);腫瘤生長抑制率=(1-藥物組 D值 /對照組 D值 )×100%。

1.3.4 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化:培養(yǎng) 48h于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照 (圖 1)。

圖1 加藥組與對照組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞量的比較

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法:采用 SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間差異采用i2檢驗,均取 P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果 黃花蒿酵解液對乳腺癌 M CF-7細(xì)胞有抑制作用,并隨著黃花蒿酵解液劑量的加大其抑制作用增強,當(dāng)藥物濃度達(dá) 30g/L以上 ,其抑瘤作用相對恒定。

2.1 黃花蒿酵解液對 MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用 4種濃度的黃花蒿酵解液作用一定時間后均可抑制 M CF-7細(xì)胞的增殖,其抑制率最高可達(dá) 86.7%(表 1,圖 2)。

1 不同濃度黃花蒿酵解液對 MCF-7細(xì)胞增殖的影響(±s,n=4)

1 不同濃度黃花蒿酵解液對 MCF-7細(xì)胞增殖的影響(±s,n=4)

(P＜0.05)

抑制率(%)組 別細(xì)胞增殖情況(OD值)48h 48h 10g/L 0.84±0.083 10.0 20g/L 0.48±0.006 48.7 30g/L 0.14±0.008 85.2 40g/L 0.12±0.025 86.7對照組 0.93± 0.082 0

圖2 藥物作用 48h后細(xì)胞存活率(M TS法)

討 論 目前國內(nèi)外有許多體外實驗證實青蒿素及其衍生物對乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑色素瘤和白血病細(xì)胞株高度敏感[1]。但青蒿素的提取工藝復(fù)雜,并多用于工業(yè)提取,很難被人體吸收;且其抗乳腺癌作用并沒有它的衍生物如雙氫青蒿素、青蒿琥酯等作用強,故而我們采用新型的制備方法,制成黃花蒿酵解液,其主要成分為青蒿素的類似物,這種制備工藝不僅簡便,且可節(jié)省原材料,其成品還可用于口服,易于被人體吸收,使用方便。

通過使用不同的藥物濃度進(jìn)行實驗,發(fā)現(xiàn)黃花蒿酵解液對MCF-7細(xì)胞作用 48h具有很強的殺傷作用,其抑制率最高可達(dá):86.7%,最低達(dá):10.0%。文獻(xiàn)表明,腫瘤藥物敏感實驗體外實驗結(jié)果與體內(nèi)化療療效總符合率高達(dá) 85%[7]。

以上結(jié)果顯示,此酵解液對 M CF-7細(xì)胞可能有殺傷作用。但是,由于本藥物為純中藥制劑,雖然僅黃花蒿一味藥物,然而其具體成分復(fù)雜,難以分析完全。實驗中我們遇到很多問題有待解決,如本藥物的滲透壓無法用一般的冰點滲透壓儀測出,而滲透壓過高或過低都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。再如,實驗前測得本藥物偏酸,眾所周知,藥物偏酸也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡,故而前面的結(jié)果值得懷疑。實驗過程中我們曾想過辦法中和本藥物的酸性,并調(diào)節(jié)本藥物的滲透壓 ,但都認(rèn)為不妥。中藥作為一種特殊的藥物,主要是依靠其藥物的偏性(毒性)發(fā)揮作用的 ,藥物的四氣五味,劑型,劑量 ,煎煮方法、火候 ,加水的多少等等都會直接影響療效。本藥物有其固定的劑型,一經(jīng)改變某些條件,則可能不再是本研究藥物。我們考慮這些問題在動物體內(nèi)可能會被均衡掉,或者經(jīng)過某些轉(zhuǎn)換中和掉這些因素,再或者本藥物有可能就是靠這些性味發(fā)揮作用,這些機理暫無法求證。以上問題幾乎所有純中藥在作體外實驗時均可能遇見。

[1] Chen PQ,Yuan J,Du QY,et al.Effectsof dihydroartemisinin on fine structure of srythrocytic stages of plasmodium berghei ANKA strain[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(3):234.

[2] 韓 銳.腫瘤化學(xué)預(yù)防及藥物治療 [J].北京:北京醫(yī)科大學(xué)和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1991.418.