常燕飛 方 艷 應(yīng)小平 西電集團(tuán)醫(yī)院(西安 710077)

實(shí)驗(yàn)材料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 健康 SD大 10只(雌、雄各半 ),6～ 8周齡,體重 250± 5g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(軍 )2002-005;S-180肉瘤瘤株,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要藥品、試劑及儀器 山仙顆粒(SXG):由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供(生產(chǎn)日期 090328),按中藥人、鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)換算后,按小鼠 4g/kg/d(臨床等效劑量 10倍)給藥,配置比例為山仙顆粒(g):生理鹽水(mL)為 1∶2,即配成0.5g/mL的混懸液。

主要試劑:fas單克隆抗體(Santa Cruze公司),二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒 PV6002、DAB顯色劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

主要儀器:超凈工作臺(tái) (蘇州凈化設(shè)備廠),電子稱(chēng)(上海第二分析儀器廠),水平離心機(jī)(LD-42型,北京醫(yī)用離心機(jī)廠),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海醫(yī)療器械廠,HH? B11? 420),倒置顯微鏡(尼康 TS100),光學(xué)顯微鏡(尼康 DXM1200F)

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 大鼠血清的制備 2.1.1 大鼠山仙顆粒劑含藥血清制備:正常 SD大鼠隨機(jī)抽取 5只 ,體重 250±5g,按中藥人、鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)換算后 ,按小鼠 4g/kg/d(臨床等效劑量 10倍)給藥,配置比例為山仙顆粒(g):生理鹽水(mL)為 1∶2,即配成 0.5g/mL的混懸液,于上午 9點(diǎn)及下午 3點(diǎn)各 1次,連服 7d后,于末次給藥后 2h后 3%戊巴比妥鈉 0.15mL/100g-1腹腔注射麻醉,,頸動(dòng)脈取血,離心取血清,56℃、30min滅活補(bǔ)體 ,除菌過(guò)濾后,-20℃分裝凍存。

2.1.2 正常大鼠血清制備:正常 SD大鼠隨機(jī)抽取 5只,體重 250±5g,灌胃等量生理鹽水 ,方法同上。

2.2 S-180肉瘤細(xì)胞體外培養(yǎng) 采用 M TT法,S-180細(xì)胞用含青霉素 G100U? mL-1、鏈霉素 100mg? L-1及 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)液稀釋成 5×105? mL-1瘤細(xì)胞懸液,向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入 1800μL瘤細(xì)胞懸液;對(duì)照組加入200 μL小牛血清 ,空白 1組加入 200 μL正常 SD正常大鼠血清,空白 2組加入 20 μL正常鼠血清及 180 μL小牛血清,用藥 1組(大劑量組)加 200 μL鼠含藥血清;用藥 2組(小劑量組 )加入20 μL鼠含藥血清及 180 μL小牛血清;每一濃度設(shè) 3復(fù)孔。37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè) 2.3.1 于 24h、48h、72h分別收集S-180培養(yǎng)細(xì)胞,離心沉淀,檢測(cè)其 Fas蛋白的表達(dá):采用免疫細(xì)胞化學(xué) SP(Histostain-Plus)法:將收集的 S-180培養(yǎng)細(xì)胞鋪片,常規(guī)水化,PBS洗片 5min×3次,0.3%H2O2(用甲醇稀釋)室溫處理 10min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,PBS洗片 5min× 2次;將其浸入 0.01mol/L、ph6.0檸檬酸鹽緩沖液中,微波 III檔(98℃)10min× 2次,自然冷卻 ,約 20min;PBS洗片 3min× 3次;加入 Fas兔抗鼠多克隆抗體(1∶ 100),4℃、濕盒過(guò)夜;PBS洗片 3min×3次;加入生物素化羊抗兔第二抗體(1∶200),37℃、40min;PBS洗片 3min×3次;加入封閉液 1∶200稀釋的Streptavidin-HRP,37℃、30min,PBS洗片 3min× 3次;0.04%DAB+0.03%H2O2顯色,10min,充分水洗 5min;蘇木素襯染1min,水洗藍(lán)化;常規(guī)脫水、透明,中性樹(shù)膠封片。每例標(biāo)本隨機(jī)選取 10個(gè)高倍鏡視野(400×),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率 ,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率及染色強(qiáng)度計(jì)算評(píng)分。①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):＜5%為 0分,5%～ 25%為 1分,25% ～ 50為 2分,50%～ 75%為3分,＞75%為 4分。②染色強(qiáng)度:0分為無(wú)染色,1分為淡黃色,2分為黃色,3分為棕黃色 /棕褐色。③兩者乘積＞1分為陽(yáng)性,≤1分為陰性。

2.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用使用 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果 各組 S-180肉瘤細(xì)胞 fas表達(dá)水平的測(cè)定情況,見(jiàn)表 1。

表1 各組 S-180肉瘤細(xì)胞 fas表達(dá)水平的測(cè)定表

表明:SXG含藥血清能上調(diào) S-180肉瘤細(xì)胞中的 fas表達(dá)水平。

結(jié) 論 細(xì)胞凋亡(apoptosis)也叫程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death),屬細(xì)胞的主動(dòng)死亡。但當(dāng)細(xì)胞受到某些外界因素作用時(shí),其代謝與調(diào)節(jié)過(guò)程改變,出現(xiàn) DNA斷裂等變化,從而產(chǎn)生凋亡。凋亡過(guò)程受一系列基因調(diào)控,其中 Fas是位于細(xì)胞膜上的細(xì)胞凋亡基因受體(亦稱(chēng)為 CD95APO-1),Fas與其天然配體 Fas L(Ligand)構(gòu)成 Fas系統(tǒng) ,二者結(jié)合后即出現(xiàn)凋亡信號(hào),導(dǎo)致表達(dá) Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡[1]。 Fas和 Fasl是一種免疫防御系統(tǒng),有人稱(chēng) Fas和 Fasl為一組抑癌基因。當(dāng)Fas與 Fasl的表達(dá)或功能異常時(shí),可導(dǎo)致 Fas系統(tǒng)信號(hào)破壞,不能進(jìn)行正常的誘導(dǎo)凋亡作用,從而使異常細(xì)胞逃避了機(jī)體的免疫監(jiān)視,發(fā)展成惡性腫瘤即可逃逸其凋亡[2]。故惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與 Fas丟失,逃避通過(guò) Fas/FasL系統(tǒng)的清除作用有關(guān)。Fas/Fasl的深入研究顯示:Fas/FasL在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)是隨著腫瘤惡性程度的提高,Fas的表達(dá)下調(diào),FasL的表達(dá)上調(diào)。因此 ,腫瘤的 Fas表達(dá)明顯下降或丟失、FasL的高水平表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生并持續(xù)發(fā)展的重要機(jī)制之一。Husain等[3]研究發(fā)現(xiàn),FasL陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移后更易生長(zhǎng)。劉曉紅等[4]發(fā)現(xiàn) ,FasL上調(diào)與乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺癌臨床分期密切相關(guān)。另外 Fas/FasL的表達(dá)情況還有重要的預(yù)后意義。 Lee等[5]經(jīng)過(guò)研究后提出,肝癌細(xì)胞 FasL表達(dá)是影響肝癌術(shù)后患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素,FasL陽(yáng)性者存活時(shí)間明顯短于陰性者。由此可見(jiàn),了解腫瘤細(xì)胞 Fas/FasL表達(dá)的情況,對(duì)于預(yù)防、發(fā)現(xiàn)、診斷、治療腫瘤具有重要意義。

中藥復(fù)方制劑是中醫(yī)治療腫瘤的重要手段,是中醫(yī)辨證論治理論在臨床應(yīng)用的體現(xiàn),因而在腫瘤臨床治療上占有重要位置。復(fù)方中藥制劑山仙顆粒,組方選用具有高效益氣活血、軟堅(jiān)散結(jié)、調(diào)理脾胃作用的中藥如西洋參、龜版、鱉甲、莪術(shù)、仙鶴草、生山楂等以達(dá)益氣活血的主要功效。經(jīng)以往的臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,該方可提高機(jī)體抗腫瘤免疫、明顯改善臨床癥狀;它有抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、防復(fù)發(fā)作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明、免疫組化結(jié)果顯示山仙顆粒含藥血清大劑量組組能明顯上調(diào)體外培養(yǎng)的 S-180肉瘤細(xì)胞中促凋亡基因 fas的表達(dá),其機(jī)制可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡促凋亡基因 fas的表達(dá),調(diào)節(jié) Fas/Fasl系統(tǒng),從而誘導(dǎo) S-180肉瘤細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

[1] NagataS,GolsteinP.The Fas Death Fact or Science,1995,267(10):1449-1456.

[2] OconnellJ,O'sullivanGC,Collins JK,etal.The Fas counter attack:Fas-mediatecl Tcecl killinghy colon cancer cells expressing ligand Expmed.1996,184:1075-1082.

[3] Husain N,ChioccaEA.Co-expression ofFas and Fas ligand inma-lignant glial tumors and cell lines[J]. Acta Neuropathol Ber,l1998,95(3):287-290.

[4] 劉曉紅 ,王心明,王延齡.Fas/FasL在乳腺疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(2):158-162.

[5] Lee WC,Yu W C,Chen M F.Prognostic impact of Fas ligand onhepatocellular carcinoma after hepatectomy[J].World J Surg,2004,28(8):792-796.

[6] 王希勝,陳光偉,李宏庭,等.山仙顆粒治療惡性腫瘤 56例 [J].陜西中醫(yī),2002,23(9):778-779.