龐 勇,陳麗容,馮 卓,暢英才,吳 剛

(廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 530023)

白細(xì)胞介素(IL)是主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生的一組免疫活性因子,作用于白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞,發(fā)生多種生物學(xué)效用,共同參與機(jī)體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)[1]。近年來(lái)的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注過(guò)程中,IL的表達(dá)明顯增加,作用于白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等,參與缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)以腦缺血再灌注大鼠腦組織和血清中白細(xì)胞介素 -10(IL-10)的含量變化為指標(biāo),研究針刺抗腦缺血后炎性損傷的機(jī)制,旨在證明增強(qiáng) IL-10的表達(dá)來(lái)抑制炎性細(xì)胞的大量分泌,從而改善微循環(huán),促進(jìn)大腦血供,有利于大鼠腦神經(jīng)功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年 SD大鼠,雄性,體重(260±30)g,普通級(jí),共 110只,由廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物模型制備 將大鼠以 3%戊巴比妥(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,取頸部正中切口,鈍性分離甲狀腺,將其上翻并加予保護(hù),分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA),用絲線結(jié)扎 ECA和 CCA近心端,于ECA處置一動(dòng)脈夾,參照改良 Zea bonga方法,于 CCA近分叉處剪一約 0.2 mm側(cè)“V”形切口,插入栓線,插入深度約 18.5 mm,使栓線進(jìn)入 ICA,越過(guò)大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)開(kāi)口處,到達(dá)大腦前動(dòng)脈(anterior cerebral artery,ACA)起始部,阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血液來(lái)源,扎緊備線,甲狀腺?gòu)?fù)位,關(guān)閉并縫合皮膚切口。術(shù)中室溫保持在 25℃。術(shù)后用白熾燈照射,溫度控制在 37℃給大鼠保溫。

1.3 神經(jīng)癥狀行為學(xué)檢測(cè) 大鼠清醒后 1～2 h采用Longa等[2]的 5分制標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀;1分：不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分：行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向偏癱側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。將造模成功(2～3分)的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分成 11組,每組 10只。正常組：不予任何處理;假手術(shù)組：將線插入后隨即拔出;模型 12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h;模型 24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h;模型 48 h組：腦缺血 1 h/再灌注 48 h;普通針刺組 12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h同時(shí)進(jìn)行普通針刺;普通針刺組 24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h同時(shí)進(jìn)行普通針刺方法;普通針刺組 48 h組：腦缺血 1 h/再灌注 48 h同時(shí)進(jìn)行普通針刺方法;益腎調(diào)督針?lè)?12 h組：腦缺血 1 h/再灌注 12 h同時(shí)進(jìn)行益腎調(diào)督針?lè)?益腎調(diào)督針?lè)?24 h組：腦缺血 1 h/再灌注 24 h同時(shí)進(jìn)行益腎調(diào)督針?lè)?益腎調(diào)督針?lè)?48 h組：腦缺血1 h/再灌注 48 h同時(shí)進(jìn)行益腎調(diào)督針?lè)ā?/p>

1.4.2 治療方法 (1)正常組：不予任何處理。(2)假手術(shù)組：將線插入后隨即拔出。(3)模型組：造成局灶性腦梗塞模型不做針刺治療。(4)益腎調(diào)督針?lè)ńM：針刺百會(huì)、風(fēng)府、大椎、命門(mén)、腎俞、太溪。后兩穴用患側(cè)。方法：手捻針,百會(huì)、風(fēng)府、大椎用平補(bǔ)平瀉手法,命門(mén)、腎俞、太溪用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法,留針 30 min,每 5 min行針 1次。(5)普通針刺組：針刺患側(cè)合谷、曲池、足三里、昆侖。手捻針,平補(bǔ)平瀉手法,留針 30 min,每 5 min行針 1次。12 h針刺組于手術(shù)后 1 h針刺,處死前蓄積 1次;24、48 h針刺組 1日針兩次,處死前蓄積 1次。

1.5 標(biāo)本收集 每只造模成功的大鼠在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)麻醉,開(kāi)胸暴露心臟,自右心房取血 2 ml,4℃過(guò)夜,然后 2000 g/min離心 20 min,取上清封存,置于-20℃冰箱待測(cè);同時(shí),用 0.9%生理鹽水及 4%多聚甲醛各 200 ml作心臟灌注固定,斷頭取腦,分開(kāi)兩側(cè)大腦半球,在右側(cè)距額極 2.5 mm處向后切取 2.5 mm腦組織,稱(chēng)重,按 0.1 g∶l ml的比例加 4%多聚甲醛作腦組織勻漿 2000 g/min離心 20 min,取上清封存,置于 -20℃冰箱待測(cè)。

1.6 白細(xì)胞介素 -10的測(cè)定 白細(xì)胞介素 -10的測(cè)定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,EILSA),試劑盒的使用嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件包 SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),所有數(shù)據(jù)均采用±s表示。各組差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),繼以 LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MCAO大鼠血清中 IL-10含量的變化及針刺的影響 見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

表1 各組大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時(shí)段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時(shí)段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 IL-10(μg/ml)正常組 20.78±2.11假手術(shù)組 20.92±2.13**12 h模型組 23.03±2.28**12 h益腎調(diào)督組 30.56±3.13**▲▲12 h普通針刺組 26.70±3.00**▲▲##24 h模型組 27.26±2.59**24 h益腎調(diào)督組 42.73±2.93**▲▲24 h普通針刺組 36.96±2.12**▲▲##48 h模型組 35.70±2.18**48 h益腎調(diào)督組 50.10±2.34**▲▲48 h普通針刺組 44.42±1.89**▲▲##

2.2 MCAO大鼠腦組織中 IL-10含量的變化及針刺的影響 見(jiàn)表 2。

從表 1、表 2可以看出,與正常組比較,模型組、益腎調(diào)督組、普通針刺組腦組織與血清中 IL-10含量顯著上升,而假手術(shù)組比較差異無(wú)顯著。與同時(shí)段模型組比較,益腎調(diào)督組、普通針刺組在各時(shí)相差異具有顯著性。同時(shí)段普通針刺組與益腎調(diào)督組比較,差異具有顯著性意義,說(shuō)明兩組針?lè)ň芴岣叽笫笕毖?IL-10的含量,尤以益腎調(diào)督組增加顯著。

表2 各組大鼠腦組織中IL-10含量 (±s,n=10)

表2 各組大鼠腦組織中IL-10含量 (±s,n=10)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時(shí)段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時(shí)段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 IL-10(pg/ml)正常組 20.12±2.17假手術(shù)組 19.90±1.64**12 h模型組 24.97±1.42**12 h益腎調(diào)督組 33.64±2.35**▲▲12 h普通針刺組 30.16±2.61**▲▲##24 h模型組 34.69土 2.53**24 h益腎調(diào)督組 47.04±2.84**▲▲24 h普通針刺組 40.85±2.31**▲▲##48 h模型組 24.97±1.46**48 h益腎調(diào)督組 71.91±3.42**▲▲48 h普通針刺組 54.55±2.77**▲▲##

2.3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 見(jiàn)表3。

從表 3可以看出,與正常組比較,模型組、益腎調(diào)督組、普通針刺組差異顯著,而假手術(shù)組比較差異不顯著;各時(shí)相上模型組動(dòng)物神經(jīng)功能缺損癥狀隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減輕,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;益腎調(diào)督組與模型組在各時(shí)相上的 NSS比較,差異均具有顯著性差異,而普通針刺組與模型組在各時(shí)相上的 NSS比較,以24 h、48 h差異有顯著意義(P＜0.05)。益腎調(diào)督組與普通針刺組在各時(shí)相上的 NSS比較,以同時(shí)段 48h比較差異有顯著意義(P＜0.05),說(shuō)明益腎調(diào)督針?lè)ㄅc普通針刺方法均能提高大鼠缺血后神經(jīng)功能損傷的恢復(fù),而益腎調(diào)督針?lè)ǜ欣诖笫笊窠?jīng)肢體功能的恢復(fù)。

表3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 (±s)

表3 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 (±s)

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與同時(shí)段模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與同時(shí)段益腎調(diào)督組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 例數(shù) 12 h 24 h 48 h正常組 10 0 - -假手術(shù)組 10 0 - -模型組 10各亞組 2.4±0.51** 2.4±0.51** 2.2±0.63**益腎調(diào)督組 10各亞組 1.9±0.56**▲ 1.5±0.52**▲▲ 1.3±0.48**▲▲普通針刺組 10各亞組 2.2±0.42** 1.9±0.31**▲ 1.8±0.42**▲#

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在急性腦缺血早期,IL-10的含量在 3個(gè)觀察的時(shí)間點(diǎn)均高于正常水平,隨著時(shí)間的延長(zhǎng) MCAO神經(jīng)功能缺損癥狀隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減輕,可推測(cè),可能在急性腦缺血早期 IL-10發(fā)揮抑制促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β,TNF-a,IL-6)等的表達(dá),從而抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)以及免疫損傷,減少腦缺血后神經(jīng)元的壞死,這與文獻(xiàn)[3,4]報(bào)道相似。此外,施予針灸治療后,MCAO大鼠血清及腦組織中的 IL-10含量較沒(méi)有施予針灸治療的 MCAO大鼠明顯升高,且MCAO神經(jīng)功能缺損癥狀減輕程度均較沒(méi)有施予針灸治療的 MCAO更明顯。因此,可推測(cè)針灸在急性腦缺血早期可增高血清及腦組織中的 IL-10的含量,從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元、防治腦缺血損害的作用。

研究還表明,益腎調(diào)督針?lè)ㄅc普通針刺法均能夠不同程度的提高 MCAO血清及腦組織中 IL-10的含量,達(dá)到抑制炎性細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集和激活,而抑制細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放,從而改善微循環(huán),促進(jìn)大腦血供,利于大鼠腦神經(jīng)功能恢復(fù)的作用,而兩種針?lè)ū容^以益腎調(diào)督針?lè)ㄐЧ鼮轱@著,是臨床上值得進(jìn)一步推廣和運(yùn)用的減少腦缺血損害的一種有效的針灸療法。

此外筆者在研究中還發(fā)現(xiàn),血清及腦組織 IL-10在急性腦缺血形成后含量呈動(dòng)態(tài)變化。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了腦缺血后 12 h、24 h及 48 h血清及腦組織中 IL-10水平：缺血后 12 h IL-10表達(dá)較低,24 h及 48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)顯著增高,這與 Li HL[5]等測(cè)定持續(xù) MCAO大鼠腦 IL-17、IFN-Y和 IL-10mRNA表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)缺血后 1-12 hIL-10mRNA表達(dá)較低,24 h～6天逐漸升高的報(bào)道相符。筆者認(rèn)為,腦缺血 12 h內(nèi)由于大量的炎性因子開(kāi)始分泌,而 IL-10在 12 h內(nèi)分泌較少而消耗較多,因此 12h IL-10表達(dá)較低;可能是受血循環(huán)中 TNF-α等炎性因子的持續(xù)刺激,IL-10在 24 h及 48 h表達(dá)顯著增高,而進(jìn)行針灸治療后,IL-10在血清及腦組織中的表達(dá)更明顯的增高,因此本實(shí)驗(yàn)也證明了腦缺血針灸介入治療的越早越能減少腦缺血對(duì)神經(jīng)元的損害。

由于人力、物力、時(shí)間等客觀因素的影響,本實(shí)驗(yàn)的時(shí)段選擇具有局限性,不能涵蓋腦缺血發(fā)病的整個(gè)過(guò)程。 IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子在腦缺血的病因和發(fā)病機(jī)制中起重要作用,但其作用卻并不是獨(dú)立的,本實(shí)驗(yàn)研究的指標(biāo)尚少,不能全面的揭示腦缺血整個(gè)發(fā)病過(guò)程中多種炎性因子的表達(dá)及之間的關(guān)系,因此益腎調(diào)督針?lè)▽?duì)腦缺血后各細(xì)胞因子之間的關(guān)系及各細(xì)胞因子對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 邢成名.缺血性腦血管病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：134

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91

[3] 劉楠,陳榮華,鄭安,等.IL-10對(duì)大鼠腦缺血保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2005,40(13)：988-990

[4] 袁紅,宋穎,歐翔,等.電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 IL-6、IL-10表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(中醫(yī)臨床版),2006,13(4)：18-21

[5] Li HL,Kostulas N,Huang YM,et al.IL-17 and IFN-gamma mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in therat[J].Neuroimmunol,2001,116(1)：5