顏培宇,朱志中,王 芳,唐 強(qiáng)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040)

免疫抑制現(xiàn)象存在于多種疾病狀態(tài)中,如病毒感染、惡性腫瘤、不孕不育、腦血管病及艾滋病等。機(jī)體在疾病的狀態(tài)下,可以出現(xiàn)免疫細(xì)胞數(shù)量的減少或應(yīng)答方向的改變、細(xì)胞因子表達(dá)的異常等。多表現(xiàn)為免疫功能低下、應(yīng)答性淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少、免疫抑制性因子活性增強(qiáng)。研究證實(shí),針灸可以調(diào)整機(jī)體的免疫功能,這種調(diào)整作用多表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)以免疫抑制大鼠為模型,探討不同穴位針刺干預(yù)后免疫抑制大鼠下丘腦 SPmRNA表達(dá)的變化,并首創(chuàng)頭穴加體穴配合的針刺方法,研究其治療免疫抑制性疾病的應(yīng)用前景,為針灸臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康 SD雄性大鼠 25只,體重 200～250 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號scxk(京)2007-0001]。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

①環(huán)磷酰胺(CTX)：由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供(批號 09041121);②Real Time PCR(HaiGene,SYBR Green熒光定量試劑盒,由上海西唐生物科技有限公司提供);③化學(xué)藥品純?yōu)趵?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號 20080319);④Trizol(Invitrogen Corp,USA);⑤cDNA第一鏈合成試劑盒(HaiGene Corp,China),引物合成由上海英俊合成;⑥熒光定量PCR試劑盒(SYBRGreen,HaiGene Corp,China)。

1.3 主要儀器

熒光定量 PCR儀 ABI7500,ABI Corp,USA;Eppendof 5810R離心機(jī),Eppendof Corp,USA;Biometra–T PCR儀,Biometra Corp.Genm;脫色搖床,上海儀器有限公司;蛋白電泳系統(tǒng),上海天能。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

采用抽簽分組方法,將大鼠隨機(jī)分為 5組：正常對照組(A組),模型對照組(B組)、模型加頭針組(C組),模型加體針組(D組),模型加頭針體針組(E組),每組 5只。正常對照組與模型對照組每天捆綁不針刺。

2.2 造模方法

取鼠后,飼養(yǎng)環(huán)境控制室溫(22±1)℃,12 h光暗交替(7：00～19：00照明)。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室最初 4 d為適應(yīng)環(huán)境期,自由進(jìn)食和飲水并每日撫摸 2～3 min,以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員操作。于實(shí)驗(yàn)第 5天除正常對照組外,各組均腹腔注射新鮮配制的環(huán)磷酰胺注射液,劑量 50 mg/kg體重 3天,第 4天加強(qiáng)注射 1次,制備免疫抑制模型[1]。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水。

2.3 穴位定位及針刺方法

2.3.1 選穴及定位 選穴：頭穴(百會及四神聰)、體穴(足三里、關(guān)元)。取穴定位：參照“十一五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》和《腧穴學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖定位及擬人對照法定位。足三里穴區(qū)取穴膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約 5 mm處取之。頭穴區(qū)取穴“百會”在大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點(diǎn)(相當(dāng)于人體百會穴),旁開 4 mm叢刺兩針。

2.3.2 針刺方法 各組大鼠綁縛固定,針具選擇華佗牌 30號 1寸針灸針[2],各穴進(jìn)針 3～10 mm,留針 20 min。每隔 5 min進(jìn)行補(bǔ)法捻針。每日 1次,治療 7天。

2.4 標(biāo)本采集

于實(shí)驗(yàn)第 8日按 0.5 ml/100g體重劑量大鼠腹腔注射 25%烏拉坦,麻醉后,75%乙醇浸泡滅菌。無菌操作斷頭取腦組織,生理鹽水沖洗,切除下丘腦迅速投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 指標(biāo)檢測及 Real time-PCR檢測方法

2.5.1 RNA提取方法(Invitrogen Trizol reagent) ①組織于液氮條件下研磨粉碎,取 100 mg裝入 1.5 ml EP管中;②向每管中加入 1 ml的 Trizol Reagent;③用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀,室溫靜置5 min;④向上述裂解液中加入 200 ul氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩 15 s,待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后,室溫靜置 5 min;⑤12,000 g 4℃離心 15 min;⑥從離心機(jī)中小心取出離心管,此時勻漿液分為3層,即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;⑦向上清液中加入等體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后 20℃室溫靜置 10 min;⑧12,000 g 4℃離心 10 min;⑨小心棄去上清,緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇 1 ml(切勿觸及沉淀),輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁。2～8℃ 12 000 g離心 5 min,棄上清;⑩室溫干燥沉淀 5 min,加入 100μl無 RNase的水,55～60℃放置 10 min完成 RNA提取。

2.5.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(HaiGene,cDNA第一鏈合成試劑盒) 在 PCR管中配制混合液,在 PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：65℃5 min,然后置于冰上急冷。在 PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,在 PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃ 10 min,42℃ 30～60 min,95℃ 5 min,4℃。

2.5.3 Real Time PCR(HaiGene,SYBRGreen熒光定量試劑盒) 引物：Beta-actin引物使用 HaiGene Human-Mouse-Rat realtime PCR引物。SP基因引物(Genebank No.：J05097)：SP-F：5'-GTTCCTTTCCGTCTCAGATGTG-3';SP-R：5'-CTCCAGGTATGCCGATGTCC-3'。定量 PCR儀：beta-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,樣品 5倍稀釋,即為 1,5,25,125 copy數(shù),擴(kuò)增結(jié)果良好。beta-actin溶解曲線制作,結(jié)果良好。P標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,結(jié)果良好。樣品 5倍稀釋,即為 1,5,25,125 copy數(shù),擴(kuò)增結(jié)果正常。SP溶解曲線制作,結(jié)果良好。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組組間差異采用方差分析,以 P＜0.05作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

共納入大鼠 20只進(jìn)入結(jié)果分析(實(shí)驗(yàn)過程中麻醉意外死亡 2只、針刺過程中感染死亡 3只)。

實(shí)驗(yàn)各組大鼠下丘腦 SPmRNA檢測結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,頭穴加體穴組(E組)可明顯提高免疫抑制大鼠下丘腦 SPmRNA含量(1.09+0.86),顯著高于 B、C、D組(0.95+0.58,0.40+0.14,0.71+0.41;P＜0.05)。結(jié)果見表 1。

表1 各組大鼠下丘腦SPmRNA表達(dá)情況 (±s)

表1 各組大鼠下丘腦SPmRNA表達(dá)情況 (±s)

注：與 B組比較,*P＜0.05;與A組比較,▲P＜0.05。

組別 n SPmRNA A組 4 1.25+0.52 B組 4 0.95+0.58▲C組 4 0.40+0.14▲D組 4 0.71+0.41▲E組 4 1.09+0.86*

4 討論

SP(substance P,P物質(zhì))是一種神經(jīng)肽類激素,也是一種神經(jīng)遞質(zhì),可調(diào)節(jié)激素的分泌,對淋巴細(xì)胞的增殖、免疫球蛋白的合成和細(xì)胞因子的分泌也有影響。同時也參與了炎癥反應(yīng)。因此,P物質(zhì)是神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫共同識別的信號物質(zhì)之一[3]。許多因素都能引起內(nèi)阿片肽釋放,以針刺刺激所導(dǎo)致的阿片肽改變最為顯著。針刺可以引起中樞及外周內(nèi)源性阿片肽的釋放[4]。P物質(zhì)屬于速激肽家族,廣泛分布于中樞和外周組織中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)以紋狀體、黑質(zhì)、下丘腦、韁核、腳間核等處含量最高[5～7]。針刺足三里穴,可以提高正常大鼠的 P物質(zhì)水平[7];針刺陽明經(jīng)穴對腦腸肽的調(diào)節(jié)具有雙向性,不同穴位的影響不同,相同穴位對不同部位腦腸肽水平的影響也有差異[8]。環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不同程度的免疫抑制現(xiàn)象,是公認(rèn)制備免疫抑制模型的方法[1]。中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi),邪不可干;邪之所湊,其氣必虛”。中醫(yī)所認(rèn)為的虛證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所認(rèn)為的免疫力低下、免疫抑制非常相似。故可以采用中醫(yī)藥治療虛證的方法來治療免疫抑制性疾病。針刺可以提高機(jī)體的免疫功能,常用的腧穴有“足三里 ”、“關(guān)元 ”等強(qiáng)壯穴。 “足三里”和 “關(guān)元 ”都可以通過神經(jīng) -內(nèi)分泌 -免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)整機(jī)體的免疫功能,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體抗病能力的作用。百會頭穴區(qū)在臨床廣泛用于腦血管疾病的康復(fù)治療,取得滿意的療效。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：頭穴叢刺法具有提高腦缺血大鼠平衡、行走及抓握能力,增強(qiáng)患側(cè)肌力;能夠增加缺血半影區(qū)微管相關(guān)蛋白 -2和突觸素的表達(dá);能夠增加突觸數(shù)目,保護(hù)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)基本完整,增加突觸活性區(qū)長度及突觸后致密物質(zhì)厚度。但頭穴叢刺對免疫抑制機(jī)體的免疫功能影響尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)研究從導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗(yàn)及研究方向出發(fā),以免疫抑制大鼠為模型,探討了頭穴加體穴配合方法對免疫抑制大鼠下丘腦 SPmRNA的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：頭穴加體穴組(E組)可明顯提高免疫抑制大鼠下丘腦 SPmRNA含量,顯著高于 B、C、D組(P＜0.05)。說明頭穴加體穴的配穴方法可以顯著增強(qiáng)免疫抑制大鼠下丘腦 SPmRNA的表達(dá),并可通過神經(jīng) -內(nèi)分泌 -免疫網(wǎng)絡(luò)作用于外周組織和血液中的淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)受體,提高機(jī)體的免疫功能,使免疫抑制機(jī)體的免疫低下得到恢復(fù),為針刺臨床治療免疫抑制性疾病提供了有力證據(jù)。

[1] 高凡,錢嘉林,劉長喜,等.環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制的動物模型建立[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2004,21(4)：314-318

[2] 李辭蓉,華興邦.實(shí)驗(yàn)動物針灸器具的設(shè)計[J].上海針灸雜志,1994,13(4)：182-183

[3] 趙素賢,王秀琴.P物質(zhì)與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)[J].解剖學(xué)進(jìn)展,2004,10(4)：322-325

[4] 王玉秀.內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)功能的研究進(jìn)展[J].中國臨床康復(fù),2005,7(10)：1558-1559

[5] Santoni G,Amantini C,Luccarini R,et al.Expression of substance P and its neurokin in-1receptor on thymocytes：functional of thy mocyte apoptosis and proliferation[J].Neuroimmunomodulation,2003,10,(4)：232-246

[6] Bockmann S,Seep J,Jonas L.Delay of neurophil apoptosis bythe neuropeptides substance P：involvement of caspase cascade[J].Peptides,2001,22(4)：211-214

[7] Qian BF,Zhou GQ,Hammarstrom ML,et al.Bothsubstance P and its receptor are expressed in mouse intestinal Tlymphocytes[J].Neuroendocrinology,2001,73：358-368

[8] 唐照亮,宋小鴿,侯正明,等.大鼠海馬內(nèi)微量注射 6羥多巴胺對艾灸抗炎免疫作用的影響[J].針刺研究,2000,25(3)：184