徐育冬 靳洪濤 宋新梅 張紹君

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進行性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎，對稱性和破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳎?］。血管新生促進滑膜血管翳的發(fā)生和發(fā)展，維持血管翳的侵襲性，促進軟骨和骨破壞及關(guān)節(jié)重構(gòu)，最終造成關(guān)節(jié)畸形、強直和功能喪失。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促進血管新生的關(guān)鍵因子，可能在RA發(fā)病機制中起重要作用。在細胞因子相互作用的網(wǎng)絡(luò)中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)居于中心位置，是RA滑膜炎發(fā)生和持續(xù)的一個關(guān)鍵性因子［2］。本試驗以佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型為基礎(chǔ)，觀察腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(益賽普)對關(guān)節(jié)炎的影響，評價其療效，探討益賽普治療RA的機制、臨床應(yīng)用價值及其對滑膜組織血管增生的抑制情況。

1 材料與方法

1．1 動物與試劑 Wistar大鼠90只，雄性，體重140～160 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號 802120，許可證號SCXK(冀)2003-1-003。

完全弗氏佐劑(FCA，10 ml)購于 Sigma公司，卡介苗(BCG，50 mg/支)購自華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心。TNF-α免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物制品公司，VEGF免疫組化成套試劑盒購自晶美生物制品公司。

1．2 分組及AA大鼠模型的建立 將90只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機分為5組，分別編號Ⅰ～Ⅴ組，Ⅰ組10只，Ⅱ～Ⅴ組每組20只。Ⅰ組為正常對照組，Ⅱ組為單純造模組，Ⅲ組為造模+甲氨喋呤組，Ⅳ組為造模 +益賽普低劑量組(0．44 mg/kg)，Ⅴ組為造模 +益賽普高劑量組(0．88 mg/kg)。將FCA與卡介苗配置為含BCG 10mg/ml的水包油乳劑。試驗第1天在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射該乳劑0．2 ml致炎，誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎。而Ⅰ組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射等量0．9%氯化鈉溶液。

1．3 給藥 于致炎后第12～23天Ⅳ、Ⅴ組皮下注射益賽普，Ⅳ組予 以 益 賽 普 0．44 mg· kg－1· d－1，Ⅴ 組 予 以 益 賽 普0．88 mg·kg－1·d－1。給藥容積均為 0．1 ml/100 g，連續(xù)12 d。Ⅲ組大鼠給予甲氨喋呤2．7 mg/kg灌胃，Ⅱ組大鼠給予蒸餾水灌胃0．5 ml·只－1·d－1;給藥時間均固定在每天上午 9∶00。

1．4 測量足體積及關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)的評定 于實驗的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27 天用排水法測右足體積，分別測量 3次，取平均值。根據(jù)關(guān)節(jié)紅腫程度進行 AI的評定，標準［3］如下:0分:無關(guān)節(jié)炎;1分:個別足趾發(fā)紅、腫脹;2分:大部分足趾及足底腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下腫脹;4分:腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上，不能負重;AI=四肢關(guān)節(jié)評分之和。

1．5 病理學及免疫組織化學檢測 于致炎后第28天，處死所有大鼠并取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以備作病理及免疫組織化學檢測。常規(guī)HE染色并計算滑膜病理積分，按照程度不同分別評分［4］:0分:正常;1分:極少炎性細胞浸潤或(和)組織輕微水腫;2分:輕微浸潤;3分:中等浸潤;4分:明顯浸潤;5分:嚴重浸潤。免疫組化檢測用SABC(鏈霉親和素生物素酶復(fù)合物)法，TNF-α、HIF-1α和VEGF陽性滑膜細胞均呈顆粒狀棕黃色或棕褐色。采用真彩色圖像分析系統(tǒng)對TNF-α、HIF-1α和VEGF表達強度進行定量分析。方法［5］如下:每張切片隨機選取5個視野(×200)，系統(tǒng)自動測量出陽性染色部位的積分光密度(IOD)，5個視野的平均IOD值代表該切片TNF-α、HIF-1α和VEGF的表達情況。

1．6 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用單因素方差分析，相關(guān)性采用直線相關(guān)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 Ⅱ～Ⅴ組大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅、腫等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，給藥期間Ⅱ組死亡1只，Ⅲ、Ⅳ組各有1只受傷，剔出死亡、受傷及造模不成功的大鼠后，最終入選實驗統(tǒng)計結(jié)果的實驗動物共計45只，Ⅰ、Ⅱ組各10只，Ⅲ、Ⅳ組各9只，Ⅴ組7只。

2．2 AI值及足體積的測定 Ⅰ組大鼠無足爪腫脹，各時間點AI值均為0分，Ⅱ～Ⅴ組大鼠AI值均高于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。造模后第21～27天Ⅴ組大鼠的AI值明顯低于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05)，而Ⅲ、Ⅳ組AI值雖然均低于Ⅱ組但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組兩兩之間在各時間點AI值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

表1 4組大鼠在不同時間段AI值比較

2．3 各組不同時間段右足體積比較 試驗前5組大鼠之間右足體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。Ⅱ～Ⅴ組大鼠右足體積于造模后第15天開始明顯增高，與Ⅰ組比較，Ⅱ組于造模后第15天足腫脹程度明顯增高(P ＜0．05或＜0．01);Ⅲ～Ⅴ組于造模后第18天足爪腫脹程度明顯增高(P＜0．05)，并于第21～24天逐漸達腫脹高峰，除Ⅳ組外，Ⅲ、Ⅴ組于第27天足腫脹程度均略好轉(zhuǎn)，但與Ⅰ組比較差異仍有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。與Ⅱ組比較，Ⅲ組雖然足腫脹程度低但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，Ⅳ組于第21～24天足體積明顯低于Ⅱ組(P＜0．05)，但第27天與差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05);Ⅴ組于第21～27天足體積均明顯低于Ⅱ組(P＜0．05)。Ⅴ組于給藥12 d后足體積明顯低于Ⅲ組(P＜0．05);Ⅲ組與Ⅳ組、Ⅳ組與Ⅴ組差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表2。

表2 5組大鼠不同時間段右足體積比較ml，xˉ±s

2．4 大鼠滑膜病理學改變及病理學評分 Ⅰ組正常大鼠滑膜襯里層有1～2層滑膜細胞組成，且部分不連續(xù)?；ひr里層下層為由脂肪細胞、少量成纖維細胞、巨噬細胞和少量血管組成的結(jié)締組織。滑膜組織無炎性細胞浸潤，無纖維組織增生。Ⅱ組可見滑膜組織中等量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤，平均病理積分3．8±0．4，滑膜襯里層增生達4～6層。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織病理積分均明顯低于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0．01);Ⅴ組滑膜組織病理積分低于Ⅲ組(P ＜0．05);Ⅳ組滑膜組織病理積分與Ⅲ、Ⅴ組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表 3。

表3 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理學積分±s

表3 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理學積分±s

注:與Ⅲ組比較，*P ＜0．05;與Ⅱ組比較，#P ＜0．01

積分Ⅰ組(n=10)組別0Ⅱ組(n=10) 3．8 ±0．4Ⅲ組(n=9) 2．8 ±0．8#Ⅳ組(n=9) 2．4 ±0．6#Ⅴ組(n=7) 2．0 ±0．7*#

2．5 滑膜組織TNF-α、HIF-1α和 VEGF的表達 Ⅰ組大鼠滑膜組織有少量TNF-α、HIF-1α和VEGF的表達。與Ⅰ組比較，Ⅱ～Ⅴ組均明顯增高(P ＜0．01)。與Ⅱ組比較，Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．01);Ⅲ組TNF-α表達雖低于Ⅱ組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織HIF-1α、VEGF的表達均明顯低于Ⅱ組(P＜0．01)。Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α 表達低于Ⅲ組(P ＜0．05)，Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達低于Ⅳ組(P＜0．05)。Ⅲ、Ⅳ組滑膜組織HIF-1α、VEGF的表達均高于Ⅴ組(P ＜0．05);Ⅲ與Ⅳ組之間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05)。見表4、圖1～8。

表4 5組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、HIF-1α和VEGF IOD值比較/μm2，ˉ±s

表4 5組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、HIF-1α和VEGF IOD值比較/μm2，ˉ±s

注:與Ⅰ組比較，*P ＜0．01;與Ⅱ組比較，#P ＜0．01;與Ⅲ組比較，△P ＜0．05，與Ⅳ組比較，☆P ＜0．05

VEGFⅠ組(n=10)組別 TNF-α HIF-1α 237±48 177±51 193±14Ⅱ組(n=10) 1 105±186* 1003±238* 1030±248*Ⅲ組(n=9) 1 053±129* 794±115*# 668±129*#Ⅳ組(n=9) 835±109*#△ 739±134*# 641±108*#Ⅴ組(n=7) 661±84*#△☆ 510±105*#△☆ 440±62*#△☆

2．6 滑膜病理學評分與 TNF-α、HIF-1α和VEGF表達的相關(guān)性 滑膜組織TNF-α、HIF-1α和VEGF的IOD值分別與病理積分成直線正相關(guān)(r=0．872，P ＜0．01;r=0．810，P ＜0．01;r=0．778，P ＜0．01)。

3 討論

益賽即注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，是一種可抑制TNF-α功能的生物制劑。目前益賽普抗炎療效的可能的機制包括:(1)減少炎癥部位的細胞生成;(2)下調(diào)滑膜細胞因子的表達;(3)降低血漿MMP-1和MMP-3的水平;(4)可調(diào)節(jié)細胞的凋亡［6］。有研究結(jié)果顯示，應(yīng)用益賽普治療的RA患者關(guān)節(jié)炎癥明顯好轉(zhuǎn)。HIF-1α和VEGF在血管新生的病理和生理中炎癥具有重要作用。HIF-1α是缺氧狀態(tài)下血管生成的核心調(diào)控因子，可上調(diào)VEGF表達。研究顯示，在體內(nèi)TNF-α啟動VEGF生成以促進血管新生，抗TNF-α治療可降低VEGF生成及與RA相關(guān)的血管新生，使增生血管復(fù)原［7，8］?？筎NF-α制劑，在體外培養(yǎng)的滑膜細胞可抑制VEGF生成［9］。本實驗顯示，益賽普可抑制滑膜組織TNF-α、HIF-1α和VEGF的過度表達，且和足體積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均呈直線正相關(guān)。益賽普治療組滑膜組織TNF-α的表達低于單純造模組，而甲氨喋呤組與單純造模組差異無統(tǒng)計學意義，說明益賽普可降低滑膜組織TNF-α的表達。益賽普治療組滑膜組織HIF-1α、VEGF的表達

圖1 正?；そM織(HE×400)

圖3 TNF-α在正常大鼠滑膜的表達(免疫組化 ×400)

圖4 TNF-α在 AA大鼠滑膜的表達(免疫組化×400)

圖7 HIF-1α在正常大鼠滑膜的表達(免疫組化 ×400)

圖8 HIF-1α在AA大鼠滑膜的表達(免疫組化×400)

圖5 VEGF在下正常大鼠滑膜的表達(免疫組化×400)

圖6 VEGF在AA大鼠滑膜的表達(免疫組化×400)

圖2 增生滑膜組織(HE×400)均明顯低于單純造模組，高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組無統(tǒng)計學差異。說明益賽普可以降低AA大鼠滑膜組織HIF-1α、VEGF的表達，抑制新生血管形成，從而減少血管翳的形成。益賽普治療組大鼠滑膜組織病理積分均明顯低于單純造模組;高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組差異無統(tǒng)計學意義。說明益賽普可以有效抑制或延緩AA大鼠關(guān)節(jié)病理改變，減輕關(guān)節(jié)病變程度且成劑量依賴性。與甲氨喋呤治療組比較，益賽普高劑量組在足體積、AI、TNF-α、HIF-1α和VEGF在滑膜的表達、滑膜病理積分均明顯降低，而低劑量組與甲氨喋呤組差異無統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，說明益賽普起效早于甲氨喋呤，近期效果優(yōu)于甲氨喋呤，這可能與給藥方法不同，以及甲氨喋呤起效緩慢有關(guān)，但遠期療效尚有待觀察。

本實驗說明:經(jīng)益賽普治療的AA大鼠，從足腫脹程度、滑膜TNF-α、HIF-1α和VEGF水平、滑膜病理積分幾方面均顯著低于未經(jīng)治療的AA大鼠，近期療效優(yōu)于甲氨喋呤，其機制可能與益賽普中和TNF-α，抑制了TNF-α促炎因子的作用，從而間接抑制了對血管翳形成直接造成軟骨和骨破壞起主要作用的HIF-1α、VEGF的表達有關(guān)。

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