崔智

肝癌是一種病死率極高的惡性腫瘤，目前采用手術(shù)切除加化療介入治療，放療等多只是延緩癥狀，完全治愈非常困難［1－3］。自古中醫(yī)就對(duì)肝癌的病機(jī)、癥狀皆有詳盡的論述，現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究顯示，很多中藥復(fù)方具有抗腫瘤作用，或扶助正氣，有助于機(jī)體抗御病邪;或通過(guò)調(diào)整機(jī)體免疫力、阻斷細(xì)胞突變、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗炎排毒治療惡性腫瘤;或直接對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用;或直接特異性殺傷腫瘤細(xì)胞［4］。華蟾素注射液是以蟾皮為主要原料研制的一種水溶性制劑，具有良好的抗腫瘤作用，廣泛用于惡性腫瘤臨床治療，如胃癌、食管癌、膀胱癌、白血病等［5，6］。本研究觀察華蟾素注射液聯(lián)合化療對(duì)BALB/C小鼠原位移植H22肝癌腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動(dòng)物:BALB/C小鼠40只，均為雄性，體重20～25 g，7～8周齡。南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(粵)2006-0015。小鼠移植性肝癌瘤株，由華西醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1．1．2 試藥:華蟾素注射液:安徽金蟾生化股份有限公司，5 ml/支;5-氟尿嘧啶(5-Fu):天津氨基酸公司人民制藥廠，針劑，250 mg/支。滅菌0．9%氯化鈉溶液稀釋至2．5 mg/m l后分裝于EP管并用錫紙避光常溫保存。

1．1．3 儀器:流式細(xì)胞儀(EPICS型):美國(guó) Beckmancoulter公司;自動(dòng)平衡離心機(jī)(DT5-6A):北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;酶標(biāo)儀(生物梅里埃中國(guó)有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱，Eppendof管，小鼠腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海希美生物科技有限公司);LKB-V型切片機(jī)。

1．2 方法

1．2．1 分組:將BALB/C小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，即模型組，單純化療組(5-Fu)，華蟾素注射液組，化療(5-Fu)+華蟾素注射液組。

1．2．2 造模及給藥方法［7］:小鼠移植性肝癌瘤株，接種于BALB/C鼠腹腔內(nèi)傳代，傳代7 d后，無(wú)菌抽取乳白色H22肝癌腹水，0．9%氯化鈉溶液洗滌2次，每次離心1 000 r/min，5 min。離心后棄去上清，0．2%臺(tái)盼藍(lán)染色鏡檢細(xì)胞活力 ＞98%，0．9%氯化鈉溶液調(diào)整癌細(xì)胞數(shù)至2．5×107/ml，4℃?zhèn)溆谩Ｓ名}酸氯胺酮(42 mg/kg)和速眠新Ⅱ(0．42 ml/kg)混合液肌內(nèi)注射麻醉小鼠。將小鼠仰臥，固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒鋪巾，于上腹正中線劍突下做一約0．8 cm的切口進(jìn)入腹腔。暴露肝臟，輕壓雙側(cè)肋弓以擠出左肝葉，濕紗布?jí)|于肝葉下方進(jìn)行保護(hù)，然后用1 ml注射器針頭沿肝葉長(zhǎng)軸方向與肝臟成30°斜插入肝實(shí)質(zhì)約0．5 cm，緩慢注入H22肝癌腹水0．03ml(細(xì)胞數(shù)為7．5×105)。在緩慢拔出針頭的同時(shí)，迅速在針眼處壓一直徑約0．5 cm大小的明膠海綿，并在其上用棉簽輕壓1 min止血，然后在針眼周圍用乙醇棉球輕搽以殺死殘留癌細(xì)胞。小心將肝臟輕柔回納腹腔，逐層縫合切口，手術(shù)完畢。術(shù)中平穩(wěn)進(jìn)針，避免刺破肝臟，防止癌性腹水漏入腹腔。術(shù)后自由進(jìn)水、進(jìn)食。術(shù)后48 h小鼠仍存活，且無(wú)癌性腹水出現(xiàn)則視為造模成功。造模48 h后，按照以下方法給藥:模型組:0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液，腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d;單純化療組(5-Fu):30 mg/kg，腹腔注射，隔日1次，連續(xù)5次;華蟾素注射液組:華蟾素注射液5 m l/kg，腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d;化療(5-Fu)+華蟾素注射液組:5-Fu 30 mg/kg，腹腔注射，隔日1次，連續(xù)5次;華蟾素注射液5 ml/kg，腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d。

1．2．3 觀察指標(biāo):①抑瘤率［8］及胸腺指數(shù)于給藥結(jié)束后第3天將小鼠稱重，摘除眼球法取血處死小鼠，完整剝離腫瘤組織和胸腺組織，剔除周圍結(jié)締組織和脂肪，用濾紙吸干臟器表面水分，電子天平稱重，計(jì)算抑瘤率和胸腺指數(shù)。抑瘤率=(1－給藥組腫瘤質(zhì)量/模型組腫瘤質(zhì)量)×100%;胸腺指數(shù)=［胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g)］×10。②血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α濃度:小鼠摘取眼球取血，于4℃保存過(guò)夜后，于1 000 r/min離心20 min，取上清液。將洗滌液用三蒸水按1∶20稀釋;于臨用前將標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液稀釋至1 ml，蓋好靜置10 min以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度2 000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別 稀 釋 2 000 pg/ml，1 000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62．5 pg/ml，31．2 pg/ml，樣品稀釋液(0 pg/ml)直接作為空白孔。進(jìn)行加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔(7孔)、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl;輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 min;棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μl，37℃，60 min。溫育60 min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，350 μl/孔，甩干;每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 100μl，37℃，60 min;溫育60 min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，350μl/孔，甩干;依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色;依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng);用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。③細(xì)胞周期分析和細(xì)胞凋亡檢測(cè)［9］取4組新鮮胸腺組織剪碎，用機(jī)械網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液，離心(800 r/min，5 min)洗滌3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/m l，用4℃的70%乙醇固定30 min。用含Rnase及碘化丙啶染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA測(cè)量，檢測(cè)速度為每秒鐘1 000個(gè)細(xì)胞，測(cè)量數(shù)據(jù)輸入hp-300consort 30計(jì)算機(jī)，使用Muhicycle軟件分析細(xì)胞周期。以二倍體峰前出現(xiàn)亞二倍體峰表示凋亡百分率;以增殖指數(shù)(PI)=(S期細(xì)胞數(shù)+G2/M期細(xì)胞數(shù))/(G1+S+G2/M細(xì)胞數(shù))表示細(xì)胞增殖活性。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，不同組進(jìn)行單因素方差分析，各組間采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 抑瘤率和胸腺指數(shù) 各治療組小鼠平均腫瘤組織重量均較模型組顯著降低(P＜0．01)，見表1;華蟾素注射液組和化療+華蟾素注射液組較模型組胸腺平均重量和胸腺指數(shù)明顯增高(P＜0．01)，單純化療組較模型組胸腺平均重量和胸腺指數(shù)明顯減低(P ＜0．01)。見表2。

表1 4組小鼠腫瘤重量及抑瘤比較n=10，±s

表1 4組小鼠腫瘤重量及抑瘤比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．01

組別 腫瘤重量(g) 抑瘤率(%)2．91 ±0．19單純化療組 1．52 ±0．12* 47．82華蟾素注射液組 1．70 ±0．10* 41．53化療 +華蟾素注射液組 1．33 ±0．14*模型組54．28

表2 4組小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)比較n=10，±s

表2 4組小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．01

胸腺指數(shù)模型組組別 胸腺重量(g)52±6 19±7單純化療組 24±10* 8±3*華蟾素注射液組 82±12* 36±13*化療+華蟾素注射液組 72±10* 28±12*

2．2 血清TNF-α濃度 與模型組比較，各藥物治療組血清TNF-α濃度明顯降低(P＜0．05);各藥物治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見表3。

2．3 腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況 與模型組比較，各藥物治療組腫瘤細(xì)胞凋亡率及PI均明顯增高(P＜0．05);化療 +華蟾素注射液組較單純化療組細(xì)胞凋亡率及PI均明顯增高(P＜0．05);單純化療組和華蟾素注射液組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見表4。

表3 4組小鼠血清血清TNF-α濃度比較n=10，fmol/m l，±s

表3 4組小鼠血清血清TNF-α濃度比較n=10，fmol/m l，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05

濃度模型組組別 血清TNF-α 16．4 ±3．0單純化療組 12．0 ±2．6*華蟾素注射液組 12．2 ±3．5*化療+華蟾素注射液組 12．2±2．7*

表4 4組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率和PI情況比較n=10，±s

表4 4組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率和PI情況比較n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05;與單純化療組比較，#P ＜0．05

PI模型組組別 凋亡率(%)8．7 ±0．6 12．2 ±1．9單純化療組 24．0 ±1* 28．1 ±0．3*華蟾素注射液組 23．8 ±2．0* 28．0 ±0．7*化療 +華蟾素注射液組 33．3 ±1．0*# 47．0 ±1．0*#

2．4 腫瘤細(xì)胞的周期比例 單純化療組對(duì)腫瘤細(xì)胞S期有阻滯作用;華蟾素注射液阻滯腫瘤細(xì)胞于S期;化療+華蟾素注射液組同時(shí)作用于細(xì)胞周期的S期及G2/M期。見表5。

表5 4組小鼠腫瘤細(xì)胞的周期比例n=10，±s

表5 4組小鼠腫瘤細(xì)胞的周期比例n=10，±s

注:與模型組比較，*P ＜0．05

組別 G0+G1期(%) S期(%) G2/M期59．4 ±3．7 25．4 ±1．1 24．2 ± 3．8單純化療組 58．9 ±9．4 16．2 ±0．8 25．0 ±4．3華蟾素注射液組 60．4 ±8．8 26．8 ±3．3 12．8 ±2．8*化療 +華蟾素注射液組 76．7±1．9 12．3±3．5* 10．9±3．4模型組*

3 討論

原發(fā)性肝癌(HG)是最常見的惡性腫瘤之一，全球2002年肝癌的發(fā)病人數(shù)626 000人，死亡人數(shù)598 000人［10］。目前在我國(guó)已屬癌癥死因的第2位，農(nóng)村地區(qū)則為第1位。肝癌對(duì)化療不敏感，尤其對(duì)于晚期肝癌患者，至今沒(méi)有可靠的證據(jù)證明全身化療可以提高晚期肝癌的總生存期(overall survival，OS)。

中醫(yī)治療肝癌歷史悠久，從《內(nèi)經(jīng)》到《諸病源候論》、《外臺(tái)秘要》等，認(rèn)為肝癌是以臟腑氣血虧虛為本，氣、血、濕、熱、瘀、毒互結(jié)為標(biāo)，主病在肝，逐漸徵積而成。臨床上肝癌病情復(fù)雜，本虛標(biāo)實(shí)明顯，臨床施治時(shí)，既要注意其本虛，常用健脾益氣，養(yǎng)血柔肝，滋補(bǔ)陰液等法以補(bǔ)虛，更要顧及邪實(shí)，以活血化瘀，消積理氣，利水消腫等法以祛邪，達(dá)到攻補(bǔ)兼施，祛邪不傷正，扶正以達(dá)邪的功效。

經(jīng)過(guò)各種治療手段的摸索，很多研究表明聯(lián)合治療優(yōu)于單一治療，而且近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)很多中藥成分具有很強(qiáng)的抗癌作用。蟾蜍(蟾酥)便是中醫(yī)較早用于治療癌癥的藥物。李時(shí)珍在《本草綱目》中指出其主治“疔瘡惡腫，一切瘡毒”等，唐人段成式也在其《酉陽(yáng)雜俎》中提到“蟾蜍矢能已毒瘡”。近代科學(xué)家從中分離出以含氨酸代替精氨酸的一系列蟾蜍毒素化合物，發(fā)現(xiàn)其藥物作用包括對(duì)抑制Na+-K+-ATP酶，強(qiáng)心作用，局部麻醉作用，抗腫瘤作用。臨床多用于治療癰疽、腫瘤、疳積、瘰疬等癥。機(jī)制認(rèn)為與下列途徑有關(guān):(1)抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解和呼吸過(guò)程。(2)通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶的作用，使細(xì)胞內(nèi)K+濃度下降，DNA合成被抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。(3)提高細(xì)胞內(nèi)CAMP濃度，促進(jìn)非組蛋白型蛋白質(zhì)的磷酸化，啟動(dòng)遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)細(xì)胞向正常分化。(4)提高機(jī)體免疫能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力。(5)通過(guò)機(jī)體必須微量元素( 鋅、硒、銅、錳、鉻)而發(fā)揮抗癌作用［11，12］。

蟾蜍的多種制劑也被用于臨床抗癌治療中，如江蘇省啟東肝癌研究所應(yīng)用復(fù)方蟾龍片(蟾蜍、守宮)治療肝癌，在資料較完整的120例中，有效率大50%以上。其中生存期超過(guò)半年的有30例，超過(guò)1年以上的12例，超過(guò)2年以上的3例。啟東肝癌研究所對(duì)存活1年以上的85例原發(fā)性肝癌進(jìn)行了分析，有2例應(yīng)用了大劑量蟾蜍的各類制劑。這2例臨床癥狀消失，AFG檢查轉(zhuǎn)陰，肝臟縮小，存活3年以上，其中1例還能參加輕微勞動(dòng)［10］。

本研究提示，華蟾素注射液組和單純化療組均可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，化療+華蟾素注射液組使抑瘤作用增強(qiáng)。華蟾素注射液組可以使小鼠胸腺重量及胸腺指數(shù)增加，考慮與其提高機(jī)體免疫力相關(guān)。TNF-α具有抗病毒，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)效應(yīng)，在實(shí)體瘤患者體內(nèi)TNF-α?xí)惓Ｉ?，?yán)重破壞細(xì)胞因子間正向的協(xié)調(diào)作用，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，造成血管滲漏，脂肪降解等病理?yè)p傷。華蟾素注射液可以顯著降低肝癌小鼠TNF-α水平，略高于單純化療組，考慮華蟾素注射液可以抑制肝癌小鼠TNF-α水平異常升高，并使其維持在一定水平來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等作用。

在細(xì)胞增殖周期中，在G期和S期之間以及G2期和M期之間，存在著影響細(xì)胞周期進(jìn)行的控制點(diǎn)，藥物可能通過(guò)調(diào)控這些控制點(diǎn)來(lái)影響細(xì)胞增殖。研究中通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相分布的觀察發(fā)現(xiàn)，同模型組相比，單純化療組的腫瘤細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例增加，華蟾素組的腫瘤細(xì)胞S期細(xì)胞比例增高，化療+華蟾素組的腫瘤細(xì)胞G2/M期、S期細(xì)胞比例均高于模型組，也就是抑瘤作用加強(qiáng)。因此，5-Fu聯(lián)合華蟾素可以增加對(duì)小鼠原位移植H22肝癌的抑瘤作用，并能減輕用5-Fu進(jìn)行化療時(shí)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。

1 陳俊華，馮國(guó)菊，軋春妹．護(hù)理干預(yù)對(duì)肝癌患者介入治療生活質(zhì)量的影響分析．河北醫(yī)藥，2009，31:749．

2 谷先之，殷蔚伯，劉泰福主編．腫瘤放射治療學(xué)．北京:第1版．北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993．584-592．

3 Meng ZQ，Guo WJ，Yu EX，et al．Inhibition of telomerase activity and induced apoptosis of liver cancer cell SMMC-7721 by drug serum of Jianpi Liqiherbs．Shijie Huaren Xiaohua Zazhi，2000，8:879-882．

4 黃連玉，郭兆平．談中藥在治療惡性腫瘤中的作用．中國(guó)中醫(yī)藥雜志，2005，3:763．

5 方山．華蟾素治療晚期癌癥40例近期療效分析．安徽醫(yī)學(xué)，1987，8:18．

6 宋慶祥．華蟾素治療乳腺癌23例療效觀察．中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987，7:299．

7 姜晗昉，任軍，崔勇，等．小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表現(xiàn)．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15:174-176．

8 Rubio SC．Synergistic activity of tumor necrosis factor and interferon in a nudemose model of human ovarian cancer．Gynecol Oncol，1989，34:353．

9 左連富主編．流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù)．第1版．北京:華夏出版社，1991．14-19．

10 王瑞敏，王美春，杜麗輝，等．原發(fā)性肝癌患者介入治療中應(yīng)用臨床路徑的效果評(píng)價(jià)．河北醫(yī)藥，2009，31:3161-3162．

11 陳雨鳳，張少華．活血化瘀藥抗腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理探討．陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29:2．

12 于春艷，李薇，劉玉和，等．白花蛇舌草體外對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞Bel－7402抗腫瘤活性的研究．北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，5:221．