施怡 李曉斌 章岳山 李勇 房定珠

1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院腫瘤科，上海 200135；2.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院腫瘤科，上海 200333；3.上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)科，上海 200092

結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球范圍發(fā)病有上升之勢(shì)。結(jié)腸癌的治療仍以手術(shù)及術(shù)后化療為主。許多研究已證明結(jié)腸癌患者尤其是術(shù)后及化療的患者機(jī)體免疫功能明顯低下。如能改善患者的免疫功能，對(duì)結(jié)腸癌患者的預(yù)后會(huì)有極大的幫助?；?熱化療是內(nèi)科治療結(jié)腸癌的重要手段，化療是通過(guò)藥物直接達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，熱療是通過(guò)熱效應(yīng)清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。除熱療本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷而達(dá)到降低腫瘤負(fù)荷外，刺激機(jī)體抗腫瘤免疫，降低腫瘤細(xì)胞的免疫耐受也在治療中起著非常重要的作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cells，Treg）是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群。近來(lái)的研究表明CD4+CD25+Treg細(xì)胞能夠顯著抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，并產(chǎn)生免疫耐受。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌患者化療/熱化療前后外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平的變化以及對(duì)CTL細(xì)胞殺傷功能的檢測(cè)，旨在探討熱化療和化療對(duì)腫瘤患者免疫耐受狀態(tài)和機(jī)體抗腫瘤免疫作用的改善情況及CTL細(xì)胞殺傷功能變化。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 收集上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院腫瘤科2008年1月—2009年12月就診的Ⅲ期結(jié)腸癌患者60例臨床資料，其中男性56例，女性4例，年齡35～71歲，平均（56.5±7.3）歲。組織學(xué)類型：管狀腺癌（浸潤(rùn)潰瘍型）52例，黏液腺癌8例；分級(jí)：低分化55例，中-高分化5例，均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)。均行超聲、CT等各項(xiàng)輔助檢查。根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：ⅢA期48例，ⅢB期8例，ⅢC期4例。所有患者全身功能狀態(tài)評(píng)分（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）0～3分，外周血白細(xì)胞＞3.5×109個(gè)/L，血小板＞100×109個(gè)/L，肝腎功能正常。

1.1.2 手術(shù)情況 所有患者均行根治性手術(shù)切除。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：⑴有自身免疫性疾病史（包括AIDS和病毒性肝炎等）；⑵既往接受過(guò)同種異體骨髓移植者；⑶使用免疫抑制劑（如潑尼松、硫唑嘌呤等）；⑷患有其他惡性腫瘤者；⑸急、慢性感染者。其中30例患者接受奧沙利鉑135 mg/m2，第1～5天，5-FU 375 mg/m2，第1～5天+CF 200 mg/m2，第1～5天，化療方案治療6個(gè)療程，另30例患者接受上述同樣化療方案+熱療治療6個(gè)療程。熱療方法：通過(guò)UHR-200微波聚束腫瘤治療儀腹腔局部加熱使全身體溫升至40～41 ℃，在每個(gè)化療療程期間第1、5天治療2次，每次治療功率500～800 w，治療時(shí)間60 min。

1.1.3 試劑 PreCP標(biāo)記鼠抗人CD3、FITC標(biāo)記鼠抗人CD4、PE標(biāo)記鼠抗人CD8、PE-Cy5標(biāo)記鼠抗人CD25和PE標(biāo)記鼠抗人TCRγδ、同型對(duì)照分別為FITC標(biāo)記抗鼠IgG、PE標(biāo)記抗鼠IgG、PreCP標(biāo)記抗鼠IgG和PE-cy5標(biāo)記抗鼠IgG購(gòu)于美國(guó)BD Pharmingen公司，采用FACS 流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀分析 采用直接免疫熒光標(biāo)記法制備被檢測(cè)樣品：新鮮的肝素鈉抗凝分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），每管加細(xì)胞100 μL，分別直接加入10 μL PreCP標(biāo)記鼠抗人CD3、FITC標(biāo)記鼠抗人CD4、PE標(biāo)記鼠抗人CD8、PE-Cy5標(biāo)記鼠抗人CD25和PE標(biāo)記鼠抗人TCRγδ，連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)，同時(shí)加入FITC標(biāo)記抗鼠IgG、PE標(biāo)記抗鼠IgG、PreCP標(biāo)記抗鼠IgG和PE-cy5標(biāo)記抗鼠IgG用來(lái)作為同型對(duì)照，并充分混勻，于室溫中溫育30 min后，用PBS（pH：7.2～7.4）洗1～2次，加入0.4%多聚甲醛-PBS緩沖液重懸細(xì)胞，上FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，用CELLQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 CTL細(xì)胞殺傷功能的測(cè)定 用含0.5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將腫瘤靶細(xì)胞調(diào)整到2×105個(gè)/mL， CTL效應(yīng)細(xì)胞調(diào)整到2×106個(gè)/mL，在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，每孔加100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。并設(shè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔，靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔和靶細(xì)胞最大釋放孔。置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。200 ×g離心10 min。每孔吸出50 μL上清液，對(duì)應(yīng)加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測(cè)板中，并加入LDH基質(zhì)試劑50 μL，室溫中放置30 min，再加入終止試劑50 μL。在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光密度（A值），檢測(cè)波長(zhǎng)492 nm。特異性殺傷活性的計(jì)算：殺傷活性（%）＝［（A實(shí)驗(yàn)組－A總自然釋放）/（A最大釋放組－A總自然釋放）］×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s ）表示，用SAS8.1軟件進(jìn)行處理。資料服從正態(tài)分布，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析法；對(duì)于治療前、后CD4+CD25+Treg細(xì)胞的水平，用多樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK（Student-Newman-Keuls）檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療前后CD4+CD24+Treg細(xì)胞水平 單純化療組治療前后CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平分別為19±9和19±7，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.026，P=0.872）?；熉?lián)合熱療組治療前后19±5和15±4，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.198，P=0.012）。

2.2 治療前后CTL細(xì)胞活性 單純化療組治療前后CTL細(xì)胞活性分別為10±3和15±5，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=189.807，P=0.003）?；熉?lián)合熱療組治療前后12±3和18±5，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=236.097，P=0.001）。

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和免疫耐受密切相關(guān)［1］。Sakaguchi等［2］先前發(fā)現(xiàn)鼠源性的CD4、CD25雙陽(yáng)性T細(xì)胞亞群，無(wú)論在體內(nèi)或是體外均表現(xiàn)獨(dú)特的抑制功能，這為調(diào)節(jié)T細(xì)胞的研究提供了一個(gè)較為可靠的標(biāo)志。CD4+CD25+Treg細(xì)胞在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中均有增高［3-4］，提示腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)某種機(jī)制誘導(dǎo)了的增殖和分化，同時(shí)其水平的增加可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)［5］。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可能是參與腫瘤微環(huán)境中抑制免疫應(yīng)答的細(xì)胞之一，了解化療及熱化療前后結(jié)腸癌患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平及CTL功能，對(duì)評(píng)價(jià)患者的免疫狀態(tài)有很高的價(jià)值。奧沙利鉑聯(lián)合5-FU是臨床常用的治療結(jié)腸癌的化療方案之一?；煷蠖嗍峭ㄟ^(guò)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺傷靶細(xì)胞。但另一方面可以導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，使機(jī)體的免疫功能受到損傷。本研究通過(guò)30例結(jié)腸癌患者化療前后和30例結(jié)腸癌患者熱療聯(lián)合化療治療前后外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組結(jié)腸癌患者治療前CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平相似，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單純化療組治療后CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平均未見(jiàn)明顯變化，但化療聯(lián)合熱療組治療后CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平下降（P＜0.05）。兩組CTL細(xì)胞殺傷功能治療后均明顯增強(qiáng)，以化療聯(lián)合熱療組增強(qiáng)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能是有效的化療能夠?qū)е履[瘤的減滅，從而改變效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率，使CTL殺死靶細(xì)胞的能力得到增強(qiáng)［6］。化療直接通過(guò)殺傷腫瘤細(xì)胞降低腫瘤負(fù)荷，但會(huì)造成對(duì)機(jī)體的免疫損傷；而熱療對(duì)化療有熱增敏作用，使患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞減少更明顯，本研究觀察到化療聯(lián)合熱療組CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平明顯降低、CTL活性增強(qiáng)，除熱作用外，熱療誘發(fā)的機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)也具發(fā)揮了重要的作用。Kubista等［7］用熱療治療骨肉瘤和軟骨肉瘤，發(fā)現(xiàn)熱療后有NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺瘤活性增加，而NK細(xì)胞的非特異性免疫，對(duì)控制腫瘤的生長(zhǎng)、殺滅血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞、防止及減少血行播散起著重要作用。熱療誘發(fā)機(jī)體免疫的機(jī)制有：提高免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性、誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞再分布、解除免疫抑制因子的抑制作用、非特異性炎癥誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、改變腫瘤免疫原性等。本研究結(jié)果提示化療聯(lián)合熱療可明顯改善患者的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的活性，從而可能會(huì)減輕化療對(duì)機(jī)體的免疫損傷，化療聯(lián)合熱療可能提高患者療效和預(yù)后。

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