劉蘋蘋,楊穎秋,李 勤

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院,廣東珠海519000)

沙眼(trachoma)是由沙眼衣原體(chlamydia trachomatis)引起的一種慢性傳染性結(jié)膜角膜炎。因其在瞼結(jié)膜面表現(xiàn)形成粗糙不平的外觀,形似沙粒,故名沙眼。本病早期結(jié)膜有乳頭增生,濾泡形成,角膜血管翳,晚期眼瞼結(jié)膜發(fā)生瘢痕,致使眼瞼內(nèi)翻畸形,加重角膜損傷,嚴(yán)重影響視力,是導(dǎo)致可預(yù)防性失明的主要原因。

1 病原體及發(fā)病機(jī)制

1.1 病原體

沙眼是由沙眼衣原體所引起的特異性感染。沙眼衣原體屬于衣原體的一種。衣原體是一種嚴(yán)格寄生在細(xì)胞內(nèi),有獨(dú)特的發(fā)育周期,能通過細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞微生物。根據(jù)其所致疾病和某些生物學(xué)性狀不同可分為沙眼生物亞種(Biovar trachoma),性病淋巴肉芽腫亞種(Biovar lymphogranuloma venereum,LGV)和鼠亞種(Biovar mouse)。沙眼生物亞種眼型有A、B 、Ba、C 血清型 ,眼生殖泌尿型有 D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K10 個(gè)血清型 。淋巴肉芽腫亞種有L1、L2、L2a、L3 4個(gè)血清型 。沙眼衣原體A 、B、Ba、C 血清型主要致沙眼,也可導(dǎo)致泌尿生殖道感染。D-K血清型主要引起泌尿生殖道感染及多種并發(fā)癥,如尿道炎、前列腺炎、膀胱炎、睪丸炎、附睪炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管炎、輸卵管閉鎖、異位妊娠及肝周炎等,并成為男、女性不孕癥的重要病因,此外也可導(dǎo)致沙眼、游泳池結(jié)膜炎、新生兒圍產(chǎn)期感染(如包涵體結(jié)膜炎、肺炎、中耳炎等)。

沙眼衣原體呈球形或橢圓形,直徑為0.2-0.4 μ m。Giemsa染色呈紫紅色;Macchiavello染色呈紅色,在光學(xué)顯微鏡下可以看見。衣原體對熱抵抗力較弱,在60℃僅能存活5-10 min;對低溫抵抗力強(qiáng),在-70℃可存活數(shù)年,凍干可保存30年以上。70%乙醇0.5 min或2%的來蘇5 min均可殺死衣原體。衣原體對大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素敏感。

1.2 發(fā)病機(jī)制

沙眼衣原體感染宿主后,通過其表面結(jié)構(gòu)吸附至敏感的結(jié)膜、角膜上皮細(xì)胞上,肝硫素在此起著“橋梁”作用,但細(xì)胞表面受體和沙眼衣原體的具體作用尚不完全了解。沙眼衣原體在宿主細(xì)胞內(nèi)生長、增殖時(shí),具有一種特殊的兩相生活周期。即具有感染性、發(fā)育成熟的原體期和無感染性、發(fā)育幼稚的始體或網(wǎng)狀體期[1]。沙眼衣原體被膜脂多糖和外膜蛋白為衣原體型特異抗原。沙眼衣原體能產(chǎn)生毒素,毒素與衣原體顆粒結(jié)合在一起而不被分泌到體外。沙眼衣原體毒素有抗原性,可被免疫血清中和。機(jī)體感染沙眼衣原體后,首先反應(yīng)為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等的浸潤,隨后發(fā)生中性粒細(xì)胞反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子,如CCR-7,IL-12及干擾素誘導(dǎo)蛋白10,這些因子引導(dǎo)樹突狀細(xì)胞向感染部位游走,并誘導(dǎo)局部保護(hù)性的CD4+Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)[2]。原發(fā)感染多僅引起輕微的組織損傷,再次感染則會迅速引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),加重原有的沙眼血管翳及瘢痕形成,甚至瞼板肥厚變形,引起瞼內(nèi)翻倒睫,加重角膜混濁,損害視力。合并其他細(xì)菌性感染,也使病情加重。關(guān)于沙眼衣原體感染發(fā)病機(jī)制的較普遍觀點(diǎn)為:沙眼衣原體熱休克蛋白(c-hsp60)作為致敏原引起了宿主的自身免疫應(yīng)答。在持續(xù)性感染中,細(xì)胞因子、沙眼衣原體增殖、抗體產(chǎn)生及變態(tài)反應(yīng)的周期性變化造成了慢性炎癥和瘢痕形成。

2 臨床表現(xiàn)

有接觸史:包括家族患沙眼史、集體生活史、共同生活史?；颊叩墓ぷ?、工作性質(zhì)和工作環(huán)境。經(jīng)常從事野外工作、洗手洗臉不便或者農(nóng)村作業(yè)者沙眼發(fā)病率高。水源:詢問患者使用自來水還是井水。有學(xué)者認(rèn)為,水源傳染是沙眼流行的重要因素。個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣:是否與他人公用一盆,一條毛巾及一盆洗臉?biāo)牧?xí)慣。

急性期主要表現(xiàn)為畏光、流淚、異物感,較多黏液或黏液膿性分泌物?？沙霈F(xiàn)眼瞼紅腫,結(jié)膜明顯充血,乳頭增生,上下穹隆部結(jié)膜滿布濾泡,可合并彌漫性角膜上皮炎及耳前淋巴結(jié)腫大。

慢性期無明顯不適,僅眼癢、異物感、干燥和燒灼感。結(jié)膜充血減輕,結(jié)膜污穢肥厚,同時(shí)有乳頭及濾泡增生,病變以上穹隆及瞼板上緣結(jié)膜顯著,并可出現(xiàn)垂簾狀的角膜血管翳。病變過程中,結(jié)膜的病變逐漸為結(jié)締組織所取代,形成瘢痕。最早在上瞼結(jié)膜的瞼板下溝處,稱之為Arlt線,漸成網(wǎng)狀,以后全部變成白色平滑的瘢痕。角膜緣濾泡發(fā)生瘢痕化改變臨床上稱為Herbet's小凹。沙眼性角膜血管翳及瞼結(jié)膜瘢痕為沙眼的特有體征。

重復(fù)感染時(shí),并發(fā)細(xì)菌感染時(shí),刺激癥狀可更重,并且可出現(xiàn)視力減退。晚期發(fā)生瞼內(nèi)翻與倒睫、上瞼下垂、瞼球粘連、角膜混濁、實(shí)質(zhì)性結(jié)膜干燥癥、慢性淚囊炎等并發(fā)癥。導(dǎo)致癥狀更明顯,可嚴(yán)重影響視力,甚至失明。

3 診斷

多數(shù)沙眼根據(jù)乳頭、濾泡、上皮、上皮下角膜炎,血管翳(起自角膜緣的纖維血管膜進(jìn)入透明角膜形成)、角膜緣濾泡、Herbert小凹等特異性體征,可以作出診斷[3]。由于瞼結(jié)膜的乳頭增生和濾泡形成并非為沙眼所特有,因此早期沙眼的診斷在臨床病變尚不完全具備時(shí)較困難,有時(shí)只能診斷“疑似沙眼”,要確診須輔以實(shí)驗(yàn)室檢查。

世界衛(wèi)生組織(WHO)要求診斷沙眼時(shí)應(yīng)至少符合下述標(biāo)準(zhǔn)中的二條:(1)上瞼結(jié)膜5個(gè)以上濾泡;(2)典型的瞼結(jié)膜瘢痕;(3)角膜緣濾泡或Herbert小凹;(4)廣泛的角膜血管翳。

1987年世界衛(wèi)生組織(WHO)介紹了一種新的簡單分期法來評價(jià)沙眼嚴(yán)重程度[4]。(1)TF:上瞼結(jié)膜5個(gè)以上濾泡;(2)TI:彌漫性浸潤、乳頭增生、血管模糊區(qū)＞50%;(3)TS:典型的瞼結(jié)膜瘢痕;(4)TT:倒睫或瞼內(nèi)翻;(5)CO:角膜混濁。其中TF、TI是活動(dòng)期沙眼,要給予治療,TS是患過沙眼的依據(jù),TT有潛在致盲危險(xiǎn)需行眼瞼矯正手術(shù)。CO是終末期沙眼。

4 實(shí)驗(yàn)室檢查

沙眼衣原體(Ct)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有三大類:(1)細(xì)胞生物學(xué)方法:①涂片鏡檢;②細(xì)胞分離培養(yǎng)。(2)免疫學(xué)方法:①直接免疫熒光抗體測定(DFA);②酶免疫測定(ELA);③金標(biāo)法測定(DIGFA)。(3)分子生物學(xué)檢測方法:①直接檢測核酸技術(shù)(基因探針技術(shù));②核酸擴(kuò)增技術(shù):A.靶DNA擴(kuò)增;B.探針擴(kuò)增;C.雜交后信號擴(kuò)增。

4.1 細(xì)胞生物學(xué)方法

4.1.1 涂片鏡檢 取標(biāo)本后,用碘或Giemsa染色可見寄生于柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)的包涵體。但因細(xì)胞內(nèi)的包涵體脆性較大,敏感性過低,一般僅限于Ct鑒定而不用于臨床。

4.1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)[5]Ct專性細(xì)胞寄生,普通培養(yǎng)法不生長,只在活細(xì)胞內(nèi)增殖復(fù)制。一般用Mc-Coy細(xì)胞或Hela-229細(xì)胞(或Hep-2細(xì)胞)培養(yǎng),染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)包涵體。特異性100%,敏感性低于100%,此法是診斷Ct感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但操作復(fù)雜,技術(shù)及設(shè)備要求高,所需時(shí)間長,敏感性受標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存等影響較大,且各實(shí)驗(yàn)室操作步驟可不同,無標(biāo)準(zhǔn)化[6]。因而不適于臨床,多用于科研和疑難病例的終鑒定。

4.2 免疫學(xué)方法

4.2.1 直接免疫熒光抗體測定(DFA)[7]熒光標(biāo)記Ct單抗與Ct結(jié)合后,原體(Ebs)在熒光顯微鏡下發(fā)熒光。針對脂多糖(LPS)的抗體熒光弱且染色不勻;針對主要外膜蛋白(MOMP)的抗體熒光亮且非特異染色少。特異性可達(dá)100%,科研中常被用作確證實(shí)驗(yàn)。敏感性易受感染率的影響,熒光易淬滅,判斷結(jié)果易帶主觀性,需優(yōu)質(zhì)顯微鏡及經(jīng)驗(yàn)豐富者操作。不適于檢測大量標(biāo)本。但操作簡便、費(fèi)用低。

4.2.2 酶免疫測定(EIA)用酶標(biāo)記的單抗或多抗檢測Ct的LPS或MOMP,酶反應(yīng)生成有色產(chǎn)物,用酶標(biāo)儀測定。敏感性64%-98%,特異性93%-98%。在高危人群中敏感性較高,新近感染及治療監(jiān)測中敏感性明顯下降。此法簡便、操作自動(dòng)化,始于短時(shí)間內(nèi)大批量標(biāo)本檢測。但與其它常見微生物可產(chǎn)生交叉反應(yīng),如金葡菌、A群及B群鏈球菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌及其他革蘭氏陰性細(xì)菌,使特異性受影響。新一代酶免疫法(ID EIA PCE Chlamydia)采用多聚酶雙重反應(yīng)放大技術(shù),敏感性高于傳統(tǒng)酶免疫法2-5倍,為91.8%,特異性為99.8%[8]。

4.2.3 斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)測定(DIGFA)利用膠體金標(biāo)記及膜滲濾技術(shù),以Ct單抗作為包被抗體,快速檢測Ct。金標(biāo)法雖然快捷簡便,但敏感性太低,漏檢率高,從方法學(xué)上金標(biāo)試劑不存在放大效應(yīng),有多少抗原顯多少色,當(dāng)抗原量低于一定水平時(shí),就無法顯示出人肉眼可見的顏色[9]。目前臨床應(yīng)用并不令人滿意,有待進(jìn)一步完善。

4.3 分子生物學(xué)檢測方法

4.3.1 直接檢測核酸的技術(shù)(基因探針技術(shù))利用核酸分子的復(fù)性原理,用特定標(biāo)記探針檢測標(biāo)本中的靶核酸。由最初的放射性標(biāo)記逐漸發(fā)展為酶或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記。其敏感性和特異性分別為73%-96%和98%-99%,無培養(yǎng)法敏感和特異,成本高,步驟繁瑣,已逐漸失去應(yīng)用價(jià)值。

4.3.2 核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸擴(kuò)增技術(shù)主要有[10]:聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),連接酶反應(yīng)(ligase chain reaction,LCR),Qbeta復(fù)制酶試驗(yàn)(Qβreplicase test),自動(dòng)維持序列復(fù)制技術(shù)(self-sustained sequence replication,3SR),鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(strand displacement amplification,SDA),Ct基因探針轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增試驗(yàn)(gen-probe CT transcription-mediated amplification test,TMA)等。其中PCR技術(shù)被認(rèn)為將對Ct感染診斷引起革命性變化[11]。

PCR屬于一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù),用寡核苷酸指導(dǎo)的DNA合成的重復(fù)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)對靶核苷酸序列的擴(kuò)增。每個(gè)循環(huán)含變性、退火、延伸3個(gè)步驟,2 h內(nèi)經(jīng)30個(gè)循環(huán)可將靶DNA擴(kuò)增109倍。最后可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴(kuò)增的DNA。由于先將標(biāo)本中的核酸特異成份擴(kuò)增復(fù)制后再行檢出,其敏感性較直接檢測核酸大大提高[12]。PCR擴(kuò)增的靶序列有3種:(1)主要外膜蛋白(MOMP)基因。(2)隱蔽性質(zhì)?；颉?3)rRNA基因。MOMP在每個(gè)Ct的拷貝數(shù)為1,因此擴(kuò)增產(chǎn)物還可以用于Ct基因分型。隱蔽性質(zhì)粒在 Ct中拷貝數(shù)為 10,敏感性比MOMP-PCR高。rRNA基因在Ct中含量較少,故敏感性較前兩者低。除經(jīng)典PCR和PT-PCR外,有幾種特殊的PCR:(1)順序釋放酶(TETR)PCR;(2)猝滅劑標(biāo)記的核酸探針(Q-DNA)PCR;(3)自動(dòng)化PCR;(4)混合標(biāo)本(pooling)PCR。許多研究都已表明,PCR較培養(yǎng)法和EIA法都要敏感[13],而且PCR對于有癥狀或無癥狀人群同樣敏感。

4.4 PCR技術(shù)

4.4.1 PCR的基本成分 PCR反應(yīng)所需的成分主要有模版DNA,一對核苷酸引物,緩沖液,四種三磷酸脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶以及一些離子。

模版:就是需要擴(kuò)增序列的核苷酸,來源很廣,幾乎所有形式的DNA和RNA都能作為PCR反應(yīng)的模版。

引物:是與靶DNA的3'端和5'端特異性結(jié)合的核苷酸片段,是決定PCR特異性的關(guān)鍵。

緩沖液:要維持PCR反應(yīng)的pH,必須用到緩沖液,最常用的是10-50 mmol/L的 Tris-HCL,在PCR反應(yīng)中,pH值變化于6.8-7.8之間。

三磷酸脫氧核苷酸:四種三磷酸脫氧核苷酸(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)是PCR反應(yīng)的原料。一般商品化供應(yīng)的dNTP溶液pH為7.0,各dNTP的濃度為2.5 mmol/L,一般使用濃度控制在 20-200 μ mol/L。四種各dNTP分子濃度必須相等,以減少錯(cuò)配。

耐熱DNA聚合酶:耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),實(shí)現(xiàn)了PCR的自動(dòng)化,能經(jīng)受95℃以上的高溫而不失活。

其他成分:二價(jià)Mg離子能活化DNA聚合酶;DMSO有利于DNA的變性;TMAC可去除非特異擴(kuò)增,促進(jìn)PCR;甘油有利于DNA復(fù)性,不過并不是對所有PCR都有利。

4.4.2 PCR的基本過程 以擬擴(kuò)增的DNA分子為模版,首先高溫變性,將混合物加熱到94℃維持15到30秒,使模版DNA雙鏈解旋成兩條單鏈;然后逐漸降溫退火,溫度降到55℃,使引物與模版DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;最后在引物、DNA聚合酶的作用下,按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模版鏈延伸直至完成新的DNA合成。如此循環(huán)20次原始DNA將擴(kuò)增約106。經(jīng)過擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物多為介于引物與原始DNA相結(jié)合的位點(diǎn)之間的片段。

4.4.3 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模版進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR是在普通PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模版進(jìn)行定量分析[14]。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測的飛躍,而且所有反應(yīng)均在同一溶液中進(jìn)行,不需任何后處理過程,具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染的問題、自動(dòng)化程度高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、定量結(jié)果具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性的特點(diǎn)[15]。

在熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號,這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線包括3個(gè)階段:基線期,擴(kuò)增期和平臺期。只有在熒光信號擴(kuò)增期,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模版量之間存在線性關(guān)系,所以可以在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較,在熒光定量PCR反應(yīng)的指數(shù)期,需要設(shè)定一定熒光信號的閾值,一般這個(gè)閾值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號,熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過閾值被認(rèn)為是真正的信號,它可以用于定義樣本的閾值循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold,Ct)。每個(gè)模版的Ct值與該模版的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系。在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。當(dāng)信號增強(qiáng)到熒光閾值時(shí),Ct值被記錄下來。起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量PCR技術(shù)比起普通PCR,不用進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,人工分析數(shù)據(jù)等步驟。較之與以前的以終點(diǎn)法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有很大的優(yōu)勢。它操作簡便、快速高效,熒光定量PCR技術(shù)不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且可以實(shí)時(shí)檢測PCR每個(gè)循環(huán)過程中熒光信號的變化,并獲得定量結(jié)果,具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性,可以降低污染,進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增,克服了普通PCR的許多不足。

20世紀(jì)50年代以前,沙眼曾在我國廣泛流行,是當(dāng)時(shí)致盲的首要病因,20世紀(jì)70年代后隨著生活水平的提高、衛(wèi)生常識的普及和醫(yī)療條件的改善,其發(fā)病率大大下降。沙眼患者往往缺乏典型的臨床表現(xiàn),如何能確診沙眼就要更多的依賴于先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)。這樣才能更好的指導(dǎo)我們對早期及輕癥沙眼患者進(jìn)行規(guī)范化治療,從而達(dá)到消滅沙眼的最終目標(biāo)。

[1]Hammerschlag MR.The intracellular life of chlamydiae[J].Semin Pediatr Infect Dis,2002,13:239.

[2]Shaw JH,Grund VR,Durling L,et al.Expression of genes encoding Th1 cell-activating cytokines and lymphoid homing chemokines by chlamydiapulsed dendritic cells correlates with protective immunizing efficacy[J].Infect Immun,2001,69:4667.

[3]葛 堅(jiān),趙家良,崔 浩,等.眼科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:160-161.

[4]Thylefors B,Dawson CR,Jones BR,et al.A simple system for the assessment of trachoma and its complications[J].Bull World Health Organ,1987,65:477.

[5]Anon National guide line for the management of balanitis Clinical Effectiveness GroupAssociation of Genitourinary Medicine and the Medical Society of the Study of Venereal Diseases[J].J Sex Transm Infec,1999,75(Supply):85.

[6]Schachter J.Chlamydia trachomatis.The more you look,the more you findhow much is there?[J].Sex Transm Dis,1998,65:485.

[7]Stephens RS,TamMR,Kuo CC,et al.Monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis:antibody specifics and antigen characterization[J].J Immunol,1982,128:1083.

[8]Chernesky M,Jang D,Copes D,et al.Comparison of a polymer conjugateenhanced enzyme immunoassay to ligase chain reaction for diagnosis of chlamydia trachomatis in endocervical swabs[J].J Clin Microbiol,2001,39(6):2306.

[9]Lauderdale TL,Landers L,Thorneycroft I,et al.Comparison of the PACE 2 assay,two amplification assay,and clearview EIA for detection of chlamydia trachomatis in female endocervical and urine specimens[J].J Clin Microbiol,1999,37(7):2223.

[10]Bobo L,Munoz B,Viscid R,et al.Diagnosis of Chlamydia trachomatis eye infection in Tanzania By polymerase chain reaction/enzyme immunoassay[J].Lancet,1991,338(5):847.

[11]Fan J,Zhang WH,Wu YY,et al.Detection of Infections of the eye with chlamydia trachomatisby the polymerase chain reaction[J].Int Ophthal,1993,17(6):327.

[12]Bailey RL,Hampton TJ,Hayes LJ,et al.Polymerase chain reaction for the detectionof ocular chlamydial infection in trachoma-endemic communities[J].J Infect Dis,1994,170(3):709.

[13]Allen SK,Semba RD.The trachoma“Menace” in the United States,1987-1960[J].Surv Ophthalmol,2002,47:500.

[14]Rajeevan MS,Ranamukhaarachchi DG,Vernon SD,et al.Methods,2001,25:443.

[15]Ke LD,Chen Z,Yung WK.Mol Cell Probes,2000,14(2):127.