張榮娟,于穎彥

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院,上海消化外科研究所,上海200025)

癌相關(guān)基因主要包括兩大類,即原癌基因與抑癌基因。在自然或?qū)嶒?yàn)條件下原癌基因的活化或者抑癌基因的失活具有誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化功能。癌相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控異常是細(xì)胞癌變中的重要事件。在癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白作為反式作用因子(trans acting factors)與基因自身的順勢(shì)作用元件(cis acting elements)相互作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。故深入研究癌相關(guān)基因的反式作用因子,有助于我們解析癌相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,從而為以基因干預(yù)為目的的靶向治療提供有價(jià)值的理論依據(jù)。

1 酵母單雜交法

酵母單雜交法(Yeast one hybrid,Y1H)是研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種方法,它借助于酵母細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因表達(dá)分析,識(shí)別與DNA相結(jié)合的蛋白。同時(shí),由于酵母屬于真核細(xì)胞,利用該系統(tǒng)獲得的基因表達(dá)調(diào)控蛋白可以較好的體現(xiàn)真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)狀況。真核細(xì)胞基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,轉(zhuǎn)錄因子具備與DNA相結(jié)合的結(jié)合域(Binding domain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Active domain,AD)。酵母單雜交的主要原理是:酵母細(xì)胞內(nèi)的GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子,GAL4有DNA結(jié)合域和激活酵母半乳糖苷酶的上游激活結(jié)構(gòu)域,而激活結(jié)構(gòu)域又可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用,從而增強(qiáng)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。研究人員需要將含有目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA的報(bào)告質(zhì)粒整合到酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株;然后將酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域置換為cDNA文庫(kù)編碼基因,只要文庫(kù)編碼基因表達(dá)的蛋白能與目的基因DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)相互作用,便可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶,啟動(dòng)酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄(圖略),使該報(bào)告酵母株在選擇性培養(yǎng)基內(nèi)得以存活。利用Y1H系統(tǒng)檢測(cè)到的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)是處于自然構(gòu)象,克服了體外研究時(shí)蛋白質(zhì)通常處于非自然構(gòu)象的缺點(diǎn)。但該方法也存在插入的靶基因可能會(huì)與酵母內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用的假陽性結(jié)果,或者酵母表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活域融合蛋白(Gal4AD)在酵母內(nèi)不能穩(wěn)定地表達(dá)或發(fā)生錯(cuò)誤折疊等假陰性結(jié)果。Y1H技術(shù)主要用于釣取已知基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,或者鑒定DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合域。Yang等利用酵母單雜交在人乳腺組織cDNA表達(dá)文庫(kù)成功篩選到四個(gè)孤兒核受體,發(fā)現(xiàn)該類受體在調(diào)控人乳腺組織芳香酶的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[1]。NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因是食管癌相關(guān)新基因,以該基因的NF-kappa B元件核心序列作為誘餌,在人食管癌細(xì)胞系SHEEC的酵母雜交cDNA文庫(kù)中釣取到5類DNA結(jié)合蛋白,為探討NGAL基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[2]。已有多個(gè)研究小組通過酵母單雜交技術(shù)篩選到DNA結(jié)合蛋白[3,4]。

2 噬菌體展示技術(shù)

噬茵體展示技術(shù)(Phage display)于1989年由Winter和Lernerd研究組創(chuàng)立。最初主要用于抗體篩選,但亦可以用來鑒定蛋白質(zhì)-DNA相互結(jié)合。噬茵體展示技術(shù)的原理是:將外源DNA片段插入合適的噬菌體外殼蛋白基因,由噬菌體表達(dá)被修飾后的融合蛋白,但不影響和干擾噬菌體的生活周期,同時(shí)可保持外源基因表達(dá)蛋白的天然構(gòu)象。成軍課題組應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)在人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選到與cyclin B2和iNOS基因啟動(dòng)子相結(jié)合的蛋白,揭示了上述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[5,6]。以上研究的成功經(jīng)驗(yàn)為癌相關(guān)基因DNA結(jié)合蛋白的篩選提供了可借鑒經(jīng)驗(yàn)。

3 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是通過TRANSFAC或Mat-Inspector等軟件平臺(tái)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)可能的DNA結(jié)合蛋白。具體作法是:輸入靶基因以及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游足夠長(zhǎng)序列(一般需要超過2 000 bp),遞交數(shù)據(jù)庫(kù)后系統(tǒng)會(huì)輸出一系列信息,如啟動(dòng)子域、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、相匹配的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域、基因多態(tài)性(SNP)等,還可與PubMed鏈接查看相關(guān)研究發(fā)表。但該方法只能提供已知蛋白質(zhì)的信息,無法發(fā)現(xiàn)全新的、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)不存在的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。Palumbo等利用Mat-Inspector平臺(tái)篩選到MA2、RXR、PU.1以及VDR等轉(zhuǎn)錄因子在c-myb GGA重復(fù)區(qū)域的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),并在EMSA和DNAaseⅠ足跡分析中得到驗(yàn)證[7]。Li等利用Mat-Inspector平臺(tái)發(fā)現(xiàn)位于SPARC第三內(nèi)含子的SATB1結(jié)合位點(diǎn),并利用ChIP實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)[8]。

4 mRNA展示技術(shù)

mRNA展示技術(shù)(mRNA display)又稱為mRNA-蛋白質(zhì)融合體展示技術(shù),它是一種新型的、不依賴于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的體外展示技術(shù)(In vitro display),該技術(shù)使得基因文庫(kù)容量及篩選效率都獲得大幅度提高。目前已成為可用于分離具有特定化學(xué)或生化特性的多肽和蛋白質(zhì)的最佳方法之一。mRNA展示技術(shù)的原理是:化學(xué)合成興趣蛋白或小肽段的DNA文庫(kù),并在DNA的5'端添加T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子、翻譯增強(qiáng)子和翻譯起始密碼子等序列,在3'端添加親和純化標(biāo)簽。在體外利用T7 RNA聚合酶將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA,把RNA的3'端和嘌呤霉素連接子結(jié)合,帶有嘌呤霉素連接子的誘餌RNA和RNA文庫(kù)在無細(xì)胞系翻譯體系中共翻譯,mRNA與其所翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)合起來形成mRNA-蛋白質(zhì)融合體,再利用翻譯蛋白所帶的親和標(biāo)簽,用親和層析技術(shù)將mRNA-蛋白質(zhì)融合體純化出來,并對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,生成cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)融合體。采用ELISA,磁珠法等將篩選的靶物質(zhì)固定于固相載體上,含有獵物蛋白的cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)融合體通過與固相載體上的靶物質(zhì)特異性結(jié)合而得到分離,通過洗脫液將獵物cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)融合體洗脫下來,加酶分解得到cDNA,將其進(jìn)行數(shù)輪PCR,富集和分離獵物蛋白質(zhì)。日本學(xué)者Yanagawa等利用TPA反應(yīng)元件為誘餌在基因文庫(kù)中篩選到多個(gè)DNA結(jié)合蛋白異二聚體復(fù)合物如 c-jun、c-fos、junD、junB、atf2、b-atf,表明 mRNA展示技術(shù)可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中鑒定多個(gè)DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物[9]。

5 凝膠遷移率分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)

EMSA是一種可定性和定量鑒定蛋白質(zhì)與特定核酸序列的結(jié)合的技術(shù),目前已成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。其基本原理是:將蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合,通過電泳凝膠時(shí),這種與蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物比未與蛋白結(jié)合的探針相比,其在凝膠中的泳動(dòng)速度減慢,即表現(xiàn)為遷移速度相對(duì)滯后。還可通過加入特異性的抗體來檢測(cè)特定的蛋白質(zhì),從而驗(yàn)證結(jié)合的特異性。其缺點(diǎn)是由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點(diǎn),故這種體外分析獲取的結(jié)果不一定能真實(shí)反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA的結(jié)合狀況。姜安麗等對(duì)NKX 3.1基因上游的30bp序列進(jìn)行EMSA分析,在不同腫瘤細(xì)胞株核蛋白提取物檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì),初步揭示了不同腫瘤細(xì)胞系中有不同的結(jié)合蛋白,提示了不同腫瘤之間基因調(diào)控機(jī)理的差異[10]。Wu等通過EMSA和ChIP分析,研究了Vimentin不同順式元件的調(diào)控蛋白質(zhì),揭示了它們?cè)谀[瘤發(fā)展過程中的意義[11]。Park等通過EMSA技術(shù)揭示了ERT與TGF-βRⅡmRNA表達(dá)沈默的機(jī)制[12]。Gorshkova等應(yīng)用EMSA技術(shù)識(shí)別了GATA-6與NF-Y聯(lián)合調(diào)控K-ras在肺癌發(fā)生中的作用[13]。

6 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunopricipitation,ChIP)

ChIP是鑒定與特定蛋白結(jié)合的基因序列或者鑒定與特定基因區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的有效方法。包括由核酸酶消化的非變性染色質(zhì)免疫共沉淀(NChIP)和甲醛或UV光交聯(lián)的變性染色質(zhì)免疫共沉淀(XChIP)兩種手段。NChIP采用未變性的染色質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),利用內(nèi)切核酸酶消化細(xì)胞核裂解液,使染色質(zhì)成碎片,利用單克隆抗體將結(jié)合有某蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段選擇性的進(jìn)行免疫沉淀,再利用PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增及序列分析。該技術(shù)主要用于與DNA高親和力的組蛋白及其修飾體研究,如組蛋白甲基化、乙酰化修飾分析。XChIP則先將染色質(zhì)進(jìn)行變性處理,如向細(xì)胞核裂解液加入甲醛,或者利用UV輻射(260nm)以及紫外線照射[14],使DNA與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),然后利用超聲波將染色質(zhì)破碎成小片段,再用特異性抗體將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物進(jìn)行免疫共沉淀,最后逆轉(zhuǎn)交聯(lián)后分析沉淀的 DNA。ChIP的缺點(diǎn)是需要細(xì)胞數(shù)量大,限制了其在稀有細(xì)胞樣本如干細(xì)胞或組織活檢樣本研究中的應(yīng)用。基于芯片的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP on-chip)技術(shù)是鑒定全基因組范圍內(nèi)蛋白結(jié)合位點(diǎn),在整體水平識(shí)別某轉(zhuǎn)錄因子的靶基因方法。Hatzis等利用ChIP-on chip分析了TCF4(Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子)在全基因組的染色質(zhì)結(jié)合情況,并通過模序識(shí)別算法(motif discovery algorithms)揭示出TCF4結(jié)合位點(diǎn)為進(jìn)化上保守的A-C/G-A/T-T-C-A-A-A-G模序[15]。

7 DNA足跡分析(DNA footprinting analysis)

DNA足跡分析是一種可以精確檢測(cè)蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法,有DNA酶Ⅰ足跡分析和硫酸二甲酯足跡分析兩種,其中以DNA酶Ⅰ足跡分析常用。其基本原理是:DNaseⅠ可以隨機(jī)水解核苷酸序列中的磷酸二酯鍵,將DNA切成單核苷酸;而結(jié)合有蛋白質(zhì)的DNA則可免于被DNaseⅠ水解,在變性凝膠電泳的放射自顯影圖片上,相當(dāng)于蛋白質(zhì)結(jié)合部位會(huì)出現(xiàn)一空白區(qū)域,與對(duì)照組核苷酸序列條帶區(qū)相比較,此空白區(qū)恰似一足跡占據(jù)了部分核苷酸序列位置。通過與對(duì)照組的核苷酸電泳條帶對(duì)比,可以精確讀出與該蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列[16]。Li等利用EMSA和DNA酶Ⅰ足跡法分析了消化道腫瘤AFP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,在啟動(dòng)子與增強(qiáng)子區(qū)鑒定出七個(gè)C/EBP結(jié)合位點(diǎn),提出了C/EBP調(diào)節(jié)AFP基因表達(dá)的直接證據(jù)[17]。

8 紫外交聯(lián)分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用(Protein DNA interaction by UV crosslinking)

該方法原理是:經(jīng)UV輻射的DNA可把轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與其順式元件以共價(jià)鍵方式連接,從而選擇性地標(biāo)記與DNA特異性結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白,以這種方式標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子能在變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的放射自顯影下顯示DNA結(jié)合蛋白的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)。該方法在定量蛋白質(zhì)研究中具優(yōu)勢(shì),它可以依靠變性膠將交聯(lián)的DNA結(jié)合蛋白分離開來,從而直接測(cè)定相互作用蛋白的分子量以及結(jié)合的蛋白總量,還可檢測(cè)到在EMSA中所看不到的微量蛋白。這為測(cè)定蛋白質(zhì)與DNA的親和力及調(diào)控基因表達(dá)的能力提供了重要方法[18]。

9 DNA結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)靶基因的功能調(diào)控研究

將DNA結(jié)合蛋白表達(dá)載體與啟動(dòng)子報(bào)告基因載體共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型,通過細(xì)胞內(nèi)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度來鑒定該DNA結(jié)合蛋白對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控作用。利用siRNA下調(diào)DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)或過表達(dá)DNA結(jié)合蛋白來驗(yàn)證與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系。該方法優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高且速度快;但也可因轉(zhuǎn)染效率不高或不能收集長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而受到限制。已有多個(gè)研究小組利用酵母單雜交技術(shù)篩選出與啟動(dòng)子DNA結(jié)合的蛋白,并通過瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染、siRNA干擾等手段進(jìn)行了反式作用因子對(duì)啟動(dòng)子表達(dá)的功能分析[19,20]。

綜上所述,DNA結(jié)合蛋白在癌相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。DNA結(jié)合蛋白與蛋白之間、DNA結(jié)合蛋白與靶基因之間的相互作用決定了靶基因的表達(dá)。掌握以上DNA結(jié)合蛋白的識(shí)別方法,將為腫瘤相關(guān)基因的功能研究提供重要的技術(shù)支撐。

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