楊 銘 程 昕 杜志榮 王 彥 范冬梅 劉娟妮 王金宏 紀(jì) 慶 高瀛岱

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所,天津 300020）

二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體穩(wěn)定性研究①

楊 銘 程 昕 杜志榮②王 彥③范冬梅 劉娟妮 王金宏 紀(jì) 慶 高瀛岱④

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所,天津 300020）

目的:研究二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體（Diabody）在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性。方法:將抗CD3/抗Pgp Diabody置于37℃含0.2%人血清白蛋白（human serum albumin,HSB）的PBS中,孵育不同時間后,用流式細胞術(shù)（FACS）檢測其結(jié)合活性。建立K562/A02裸鼠移植瘤模型,用Cy5熒光標(biāo)記試劑盒標(biāo)記抗CD3/抗Pgp Diabody,通過尾靜脈注射給荷瘤裸鼠,在小動物活體成像系統(tǒng)上動態(tài)觀察熒光信號。結(jié)果:二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp Diabody（Ds-diabdoy）體外孵育72小時后活性無明顯下降,而改造前Diabody孵育1小時后活性即開始下降,24小時后活性完全喪失。Ds-diabdoy注射后72小時仍能在腫瘤部位檢測到熒光信號,而改造前Diabody在注射后24小時腫瘤部位熒光信號消失。結(jié)論:Ds-diabdoy較改造前Diabody穩(wěn)定性大大提高。

藥物穩(wěn)定性;Diabody;二硫鍵;多藥耐藥

①本文為天津市科技計劃資助項目（No.08ZCKFSH04100）,專利號:

CN 99125250.0,CN 02146742.0

②中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京100730

③中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所,天津300192

④通訊作者,E-mail:gaoyingdai@hotmail.com

腫瘤細胞對不同的化學(xué)相關(guān)或不相關(guān)的抗腫瘤藥物產(chǎn)生不敏感性,即多藥耐藥（Multidrug resistance,MDR）。MDR是造成腫瘤化療失敗的主要原因,產(chǎn)生MDR的原因通常是因為藥物失活或被外排泵排出腫瘤細胞[1-4]。MDR產(chǎn)生的主要分子機制是細胞表面存在一種叫做P-糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）的跨膜糖蛋白,由MDR1基因編碼,Mr為170 000。Pgp蛋白屬于ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette,ABC）轉(zhuǎn)運蛋白超家族,是ATP依賴性的藥物外排泵,能將各種不同的藥物排出細胞,從而產(chǎn)生MDR。已經(jīng)證實Pgp蛋白與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后差高度相關(guān),是評價腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一[3,5,6]。以Pgp為治療靶點已經(jīng)成為克服腫瘤耐藥的新策略。

本實驗室前期構(gòu)建了抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體（Diabody）,并進行原核可溶性表達,體外實驗證實具有良好的生物學(xué)活性,體內(nèi)實驗證實能有效地介導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞殺傷耐藥移植瘤細胞。但抗CD3/抗Pgp Diabody在體內(nèi)實驗中,停藥一周后腫瘤復(fù)發(fā),不能徹底根除腫瘤[7]?？赡芘c體外活化的T細胞在體內(nèi)不能維持其持續(xù)活化的狀態(tài),以及Diabody不穩(wěn)定有關(guān)。本實驗主要是評價引入二硫鍵的抗CD3/抗Pgp Diabody體內(nèi)外的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及實驗材料 流式細胞儀（美國Coulter公司）,小動物活體成像系統(tǒng)（KODAK Image Station in vivo FX）,Cy5熒光標(biāo)記試劑盒購自GE公司,FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG、HIT3a由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所免疫室提供,HRP標(biāo)記鼠抗E-tag單抗和抗E-tag單抗均購于Amersham Bioscience公司,BALB/c裸鼠（nu/nu）,雌性,5～7周齡,體重16～20克,購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,在SPF級動物合格環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 細胞培養(yǎng) K562、K562/A02和 Jurkat細胞由本室保存,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,于5%CO2,37℃,飽和濕度下培養(yǎng)。其中K562/A02細胞是由本室長期誘導(dǎo)的耐阿霉素的白血病細胞株,在培養(yǎng)過程中加入阿霉素以維持耐藥性,實驗前兩周停藥。

1.3 載體 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體由本室構(gòu)建保存[8]。

1.4 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體體外血清穩(wěn)定性檢測 將純化后的二硫鍵穩(wěn)定的Diabody或改造前的Diabody分別置于37℃含0.2%人血清白蛋白（HSA）的PBS中,37℃條件下孵育0、1、4、8、12、24、48 和 72 小時。在上述不同時間點分別取孵育后的抗體,與1×106K562/A02細胞或Jurkat細胞4℃共同孵育1小時,4℃,2 000 r/min,離心10分鐘。棄上清,PBS洗細胞2次,棄上清。將細胞重懸于100μl PBS中,加入抗 E-tag單抗,使其終濃度為10μg/m l,4℃孵育1小時。PBS洗3次,棄上清,將細胞重懸于20μl FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體中,4℃孵育40分鐘。至4℃,2 000 r/min,離心10分鐘。PBS洗3次,棄上清,將細胞重懸于300μl PBS中,300目尼龍網(wǎng)過濾后,FCM檢測熒光強度。同型對照中只加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。

1.5 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

1.5.1 裸鼠移植瘤模型的建立 選用BALB/c nu/nu裸鼠21只,雌性,6周齡,體重16～20克。以4Gy/只劑量進行γ射線亞致死量照射。將照射后的裸鼠,次日于裸鼠右后肢根部背側(cè)皮下接種K562/A 02耐藥細胞,每只裸鼠接種細胞數(shù)為2×107細胞/0.2m l。待腫瘤生長至直徑為0.5 cm左右時備用。

1.5.2 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體Cy5熒光標(biāo)記及標(biāo)記后的抗體活性檢測 使用GE公司Cy5熒光標(biāo)記試劑盒標(biāo)記改造前后兩種抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體。將Cy5標(biāo)記后的Diabody通過間接免疫熒光法結(jié)合流式細胞術(shù),檢測其與Pgp抗原的結(jié)合活性。

1.5.3 Cy5標(biāo)記的二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體活體成像 將標(biāo)記好的抗體通過尾靜脈注射給荷瘤裸鼠,注射劑量為4mg/kg。用乙醚將裸鼠麻醉后,分別于注射后 12、24、48和72小時在Kodak FX in vivo小動物活體成像儀下觀察熒光信號。實驗分3組,每組 7只裸鼠,如下:對照組注射游離的Cy5熒光染料;實驗組1注射改造前Diabody（Cy5標(biāo)記）;實驗組2注射二硫鍵穩(wěn)定的Diabody（Cy5標(biāo)記）。

2 結(jié)果

2.1 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體體外血清穩(wěn)定性檢測將改造前后的兩種Diabody分別于37℃含0.2%HSA的PBS中孵育,取不同時間點檢測孵育后抗體對K562/A02細胞的結(jié)合活性。改造前的Diabody在37℃含0.2%HSA的PBS中孵育1小時后活性開始下降,4小時后活性僅剩約1/2,24小時后則活性完全喪失。而dsCD3-Diabody在37℃含0.2%HSA的PBS中孵育72小時后細胞親和活性無明顯下降（圖1）。

2.2 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

2.2.1 Cy5標(biāo)記后結(jié)合活性的檢測 為了評估Cy5標(biāo)記對Diabody的結(jié)合活性是否有影響,利用間接免疫熒光方法結(jié)合流式細胞術(shù),檢測標(biāo)記后的Diabody與Pgp抗原的結(jié)合能力。實驗結(jié)果顯示與標(biāo)記前的Diabody相比,Cy5標(biāo)記的Diabody與Pgp抗原的結(jié)合活性沒有明顯下降（圖2）。

圖1 dsCD3-diabody與改造前Diabody穩(wěn)定性比較Fig.1 Serum stability of the dsCD3-diabody in com parison with the parent diabody

圖2 Cy5標(biāo)記的Diabody與 Pgp抗原結(jié)合活性的鑒定Fig.2 Identification the Pgp-binding activity of Cy5 labeled Diabody

2.2.2 二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體體內(nèi)穩(wěn)定性 本實驗利用熒光素Cy5標(biāo)記Diabody進行示蹤,直觀地觀察Diabody進入Pgp高表達的移植瘤裸鼠模型體內(nèi),在移植瘤部位定位、停留和被代謝的過程,從而比較改造前后兩種Diabody在體內(nèi)的定位和穩(wěn)定性。所有移植瘤裸鼠在注射標(biāo)記抗體后2小時均能在移植瘤部位檢測到明顯的熒光信號（圖3A2和A3）。在每個時間點二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體在移植瘤部位的熒光信號均比改造前的Diabody強（圖3A2,B2,C2和A3,B3,C3）?？贵w注射后24小時,改造前Diabody在移植瘤部位的熒光信號變得較弱,而dsCD3-Diabody在移植瘤部位的熒光信號仍然較強（圖3C2和C3）?？贵w注射后72小時,改造前Diabody在移植瘤部位的熒光信號基本不能被檢測到,而dsCD3-Diabody在移植瘤部位的熒光信號仍然可以被檢測到（圖3D2和D3）。游離Cy5對照組在所有時間點,移植瘤部位均無明顯熒光信號。

圖3 近紅外活體成像對比二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗Pgp微型雙功能抗體和改造前Diabody體內(nèi)穩(wěn)定性Fig.3 The in vivo stability of the dsCD3-Diabody in comparison with the parent Diabody

3 討論

抗體穩(wěn)定性是影響抗體療效的一個至關(guān)重要的因素。Diabody的兩條肽鏈?zhǔn)欠枪矁r結(jié)合在一起,容易解離成單體,失去活性。Diabody穩(wěn)定性差是由其結(jié)構(gòu)特點導(dǎo)致的,要想增強其穩(wěn)定性,必須從改造其結(jié)構(gòu)入手。增強Diabody穩(wěn)定性的方法主要有2種:一是用一段柔性肽將VH和VL連接在一起,形成單鏈雙特異抗體（或單鏈雙價抗體）[9];另一種是向Diabody引入二硫鍵,使兩條肽鏈共價結(jié)合在一起,形成二硫鍵穩(wěn)定的Diabody[10]。后一種方法已經(jīng)被大量實驗證實是可行的,在VL和VH適當(dāng)位置引入二硫鍵,使兩者通過共價鍵結(jié)合,可以大大增強Diabody的穩(wěn)定性[11,12]。

本實驗主要是評價引入二硫鍵的抗CD3/抗Pgp Diabody體內(nèi)外的穩(wěn)定性。在體外,將抗體置于37℃的含0.2%HAS的PBS中孵育不同時間,檢測其結(jié)合活性來評估其體外血清穩(wěn)定性。改造前的Diabody在37℃含0.2%HSA的PBS中孵育1小時后活性開始下降,4小時后活性僅剩約1/2,24小時后則活性完全喪失。而dsCD3-Diabody在37℃含0.2%HSA的PBS中孵育72小時后細胞親和活性無明顯下降。dsCD3-Diabody體外血清穩(wěn)定性顯著強于改造前Diabody。在體內(nèi),我們將抗體用Cy5熒光標(biāo)記,建立裸鼠移植瘤模型,進行示蹤,在小動物成像儀下觀察抗體在體內(nèi)的定位和代謝。結(jié)果顯示dsCD3-Diabody定位更快,在腫瘤部位停留更長。dsCD3-Diabody穩(wěn)定性增強后,療效必將顯著增強,主要由于:第一,改造前Diabody在穿透進入腫瘤深處前大部分因為不穩(wěn)定而解離,失去活性,到達腫瘤中心的Diabody數(shù)量較少。而dsCD3-Diabody因為穩(wěn)定,到達腫瘤中心部位的數(shù)量較多。另一原因可能是,根據(jù)“binding site barrier”理論 ,腫瘤細胞能夠形成一層屏障,阻止抗體到達腫瘤中心[13]。這樣能夠自由彌散進入腫瘤深部區(qū)域的抗體數(shù)量將會減少,而穩(wěn)定性更好的dsCD3-Diabody受此影響較小。體內(nèi)示蹤實驗結(jié)果與上述 2種解釋是吻合的。故dsCD3-Diabody因其穩(wěn)定性的改善,進入腫瘤內(nèi)部的有活性的抗體數(shù)量較改造前Diaobody多,并且在腫瘤部位停留時間更長,對耐藥移植瘤的殺傷作用更強。dsCD3-Diabody將具有更好的臨床應(yīng)用前景。

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[收稿2010-05-29 修回2010-06-24]

（編輯 許四平）

Stability analyze of the disulphide bond stabilized anti-CD3/anti-Pgp diabody

YANGMing,CHENGXin,DUZhi-Rong,WANGYan,FANDong-Mei,LIUJuan-Ni,WANGJin-Hong,JIQing,GAO Ying-Dai.StateLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematologyandBloodDiseasesHospital,ChineseA-cademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Tianjin300020,China

Objective:To analyze the in vitroand in vivo stability of a disulphide anti-CD3/anti-Pgp diabody.Methods:Theanti-CD3/anti-Pgp diabodywas incubated in PBS which contained 0.2%HSB at 37℃for different times,and then analyzed the binding activity by FACS.The diabody was labeled with the fluorescent dye Cy5.Labeled diabdoy was injected via tail veil into BALB/c nudemice bearingMDR（Multi-drug resistance）human xenografts.The fluorescence em ission was recorded with a whole-body small-animal imaging system.Results:The remained binding activity of ds-diadody showed no obvious decreaseafter incubation for 72 h in vitro,while the remained binding activity of the parent diabody began to decrease after incubation for1 h,and couldn'tbe detected after incubation for 24 h.Intense fluorescence could be detected for the ds-diabody at72 h post-in jection,while fluorescence for the parentdiabody disappeared at24 h post-injection.Conclusion:The data demonstrate thatds-diabody has improved stability compared with the parent diabody.

Drug stability;Diabody;Disulphide bond;MDR

R392-33

A

1000-484X（2010）12-1078-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.005

楊 銘（1970年-）,男,副主任技師,主要從事藥學(xué)方面的研究,E-mail:my1970@163.com。

·實用臨床免疫學(xué)·