于秀艷 曾常茜 劉曉峰 （吉林省腫瘤醫(yī)院,長(zhǎng)春 130012）

抗體膜片法檢測(cè)乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法學(xué)評(píng)價(jià)①

于秀艷 曾常茜②劉曉峰 （吉林省腫瘤醫(yī)院,長(zhǎng)春 130012）

目的:建立血清C-erbB-2蛋白的抗體膜片檢測(cè)方法,并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。方法:抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白,免疫組化方法檢測(cè)乳腺組織C-erbB-2蛋白。結(jié)果:30例乳腺癌、26例乳腺增生、30例正常對(duì)照組血清中C-erbB-2蛋白陽(yáng)性率分別為40.0%、7.7%和6.7%,三組相比較有顯著差異（P＜0.05）;乳腺癌組織C-erbB-2蛋白陽(yáng)性和陰性者其血清C-erbB-2蛋白陽(yáng)性率分別為91.67%和11.11%,血清與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)具有相關(guān)性（P＜0.01）;抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別為40.0%、92.8%和74.4%。結(jié)論:抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白與乳腺癌病理學(xué)診斷符合率高,且方法簡(jiǎn)便易行,臨床具有實(shí)用價(jià)值。

C-erbB-2蛋白;乳腺癌;乳腺增生;抗體膜片法

C-erbB-2蛋白是癌基因C-erbB-2編碼的跨膜糖蛋白受體,分子量為185 kD,因此又稱p185蛋白。C-erbB-2蛋白具有酪氨酸激酶活性,被異常激活后發(fā)生自身磷酸化,并磷酸化其他底物,引起下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終導(dǎo)致細(xì)胞的增殖乃至癌變。自從文獻(xiàn)報(bào)道C-erbB-2擴(kuò)增和/或過(guò)度表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系后,引起了人們對(duì)C-erbB-2及其表達(dá)產(chǎn)物研究的關(guān)注。伴隨著C-erbB-2蛋白功能的發(fā)揮,受體的細(xì)胞外區(qū)域釋放入血,血清C-erbB-2蛋白水平對(duì)于判斷乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及復(fù)發(fā)具有重要意義[1-4]。本實(shí)驗(yàn)采用抗體膜片檢測(cè)血清C-erbB-2癌蛋白,旨在為乳腺癌的診斷提供特異、敏感、實(shí)用的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 乳腺癌患者術(shù)前血清及組織30例（經(jīng)病理確診）,由吉林省腫瘤醫(yī)院提供,患者均為女性,年齡 24～75歲,其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌17例,浸潤(rùn)性小葉癌10例,導(dǎo)管原位癌1例,小葉原位癌1例,乳頭狀癌1例。乳腺增生患者術(shù)前血清及組織26例（經(jīng)病理確診）,由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供,患者均為女性,年齡23～50歲。正常血清30份,由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供,均為女性,年齡25～46歲。

1.1.2 試劑 C-erbB-2蛋白單克隆抗體（A18、A21）均為中國(guó)科技大學(xué)生命學(xué)院劉兢教授惠贈(zèng);乳腺癌細(xì)胞珠MCF-7由吉林省腫瘤研究所提供;C-erbB-2蛋白陽(yáng)性抗原為SKBR-3細(xì)胞裂解液,購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司;NC膜為丹麥NUNC公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈親合素（SA-HRP）購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司;超敏SP試劑盒、C-erbB-2單克隆抗體、DAB、C-erbB-2免疫組化陽(yáng)性對(duì)照片、多聚-L-賴氨酸均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 C-erbB-2單克隆抗體A21的生物素標(biāo)記（Bio-A21）及鑒定參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。

1.2.2 抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白 用C-erbB-2單克隆抗體（A18）溶液（20μg/m l）點(diǎn)樣5μl,待膜干燥后,用PBST洗膜5次。加1%BSA溶液37℃封閉30分鐘,用PBST洗膜5次。點(diǎn)加待測(cè)血清5μl,同時(shí)設(shè)C-erbB-2蛋白陽(yáng)性和陰性對(duì)照,37℃孵育40分鐘,PBST洗膜5次。點(diǎn)加生物素標(biāo)記的C-erbB-2蛋白單克隆抗體（Bio-A21）（1∶500）5μl,37℃孵育30分鐘,PBST洗膜5次。點(diǎn)加2μg/ml SA-HRP 5μl,37℃孵育30分鐘,PBST洗膜5次。點(diǎn)加DAB溶液5μl,37℃反應(yīng)15分鐘,斑點(diǎn)出現(xiàn)后取出。用冰醋酸終止反應(yīng)。

1.2.3 免疫組化方法檢測(cè)組織C-erbB-2蛋白表達(dá)采用SA-生物素-HRP復(fù)合物法（SP法）。按照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作,其中鼠抗人C-erbB-2單克隆抗體稀釋度為1∶200,按美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）推薦的Herlep Test評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.4 ELISA方法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白 參考文獻(xiàn)[5]的方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 χ2檢驗(yàn),以P＜0.01為差異有顯著意義,以P＞0.05為差異無(wú)顯著意義。

1.4 方法學(xué)評(píng)價(jià) 以病理診斷作為乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)血清C-erbB-2蛋白鑒別診斷乳腺癌作方法學(xué)評(píng)價(jià),計(jì)算敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 抗體膜片法和ELISA法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白結(jié)果 抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白結(jié)果見圖1,30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白12例陽(yáng)性,18例陰性,陽(yáng)性率為40.0%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白2例陽(yáng)性,24例陰性,陽(yáng)性率為7.7%。30例正常對(duì)照血清中,C-erbB-2蛋白2例陽(yáng)性,28例陰性,陽(yáng)性率為6.7%。經(jīng)χ2檢驗(yàn),乳腺癌組血清C-erbB-2蛋白與乳腺增生、正常對(duì)照組相比較有顯著差異（P＜0.05）。

上述血清標(biāo)本同時(shí)用ELISA法檢測(cè)血清C-erbB-2基因蛋白,結(jié)果30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白13例陽(yáng)性,18例陰性,陽(yáng)性率為43.3%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白3例陽(yáng)性,23例陰性,陽(yáng)性率為11.5%。30例正常對(duì)照血清中,C-erbB-2蛋白2例陽(yáng)性,28例陰性,陽(yáng)性率為6.7%。經(jīng) χ2檢驗(yàn),乳腺癌組血清C-erbB-2蛋白與乳腺增生、正常對(duì)照組相比較有顯著差異（P＜0.05）。

抗體膜片法與ELISA法檢測(cè)血清C-erbB-2基因蛋白的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)結(jié)果 30例乳腺癌組織中,C-erbB-2蛋白12例陽(yáng)性,18例陰性,陽(yáng)性率為40%。26例乳腺增生組織未發(fā)現(xiàn)C-erbB-2蛋白的表達(dá)。經(jīng)χ2檢驗(yàn),乳腺癌組織C-erbB-2蛋白的表達(dá)與乳腺增生組織相比較有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)相關(guān)性結(jié)果 30例乳腺癌組織中,12例C-erbB-2蛋白陽(yáng)性中有11例血清C-erbB-2蛋白升高,18例C-erbB-2蛋白陰性中有2例血清C-erbB-2蛋白升高。經(jīng) χ2檢驗(yàn),血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)比較P＜0.01,說(shuō)明血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)存在相關(guān)性。

圖1 血清C-erbB-2蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of seral C-erbB-2 protein

表1 血清C-erbB-2蛋白診斷乳腺癌的方法學(xué)評(píng)價(jià)Tab.1 Themethologicalevaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果 以病理診斷作為乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)血清C-erbB-2蛋白鑒別診斷乳腺癌作方法學(xué)評(píng)價(jià)。30例乳腺癌患者中12例C-erbB-2蛋白升高,26例乳腺增生患者中2例C-erbB-2蛋白升高,30例正常對(duì)照中2例C-erbB-2蛋白升高（表1）。經(jīng)計(jì)算,靈敏度=12/30×100%=40.0%,特異度=52/56×100%=92.8%,準(zhǔn)確度=64/86×100%=74.4%。

3 討論

乳腺增生與乳腺癌是臨床上常見的乳腺疾病,目前臨床最常用的鑒別方法是病理學(xué)診斷,不僅取材不便,還會(huì)給乳良增生患者造成不必要的損傷和痛苦。因此,尋找一種準(zhǔn)確、敏感的生物學(xué)指標(biāo)和檢測(cè)方法具有重要意義。

Lanrent發(fā)現(xiàn)C-erbB-2基因蛋白分子的細(xì)胞部分可以從乳腺癌細(xì)胞脫落并分泌到血清中,利用C-erbB-2蛋白胞外部分的單克隆抗體建立了ELISA方法檢測(cè)血清中C-erbB-2基因蛋白,也有學(xué)者用單克隆抗體6G10、SV-2-61、A18和A21等作為包被抗體和酶標(biāo)抗體建立EIA檢測(cè)C-erbB-2基因蛋白[5-7]。本實(shí)驗(yàn)建立了血清C-erbB-2蛋白的抗體膜片法,并對(duì)血清C-erbB-2蛋白與乳腺組織C-erbB-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)血清C-erbB-2蛋白與組織C-erbB-2蛋白表達(dá)水平存在相關(guān)性,與ELISA法無(wú)顯著差異,說(shuō)明該方法可靠性好。以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn),該抗體膜片法檢測(cè)血清C-erbB-2蛋白的靈敏度為40.0%,特異度為92.8%,準(zhǔn)確度為 74.4%,說(shuō)明該方法與臨床病理學(xué)診斷方法符合率較高。此外,該抗體膜片法克服了免疫組化方法檢測(cè)組織C-erbB-2蛋白的取材不便,與ELISA相比操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果易攜帶和保存,因此臨床實(shí)用性較強(qiáng)。本研究還有待于增加檢測(cè)例數(shù),為盡早在臨床上應(yīng)用積累更多的資料。

1 BatoriM,RuggieriM,Chatelouetal.Breast cancer in young women:case reportand a review[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2006;10（2）:51-52.

2 Dimas C,Frangos-PlemenosM,Kouskouni Eetal.Immunohistochem ical study of p185HER2 and DF3 in primary breast cancer and correlation with CA-15-3 serum tumormarker[J].Int JGynecol Cancer,2002;12（1）:74-79.

3 Leitzel K.Elavated serum c-erbB-2 antigen levelsand decreased response tohormone therapy of breast cancer[J].JClin Oncol,1995;13（5）:1129-1131.

4 Shigeru I,Hisanao O,KokichiS.Determination of cytosol c-erbB2 protein in breast cancer by sandwich Enzyme Immunoassay[J].Jpn JClin,1998;28（2）:92-94.

5 曾常茜,于秀艷,王振明.血清p185蛋白與p185糖鏈測(cè)定方法的比較[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2005;25（6）:484-487.

6 Lanrent B,Marie-Paule A,Marie-Helene Betal.Relevance of p185 HER-2/neu oncoprotein quantification in human primarybreastcarcinoma[J].BreastCancer Research and Treatment,2000;63:163-169.

7 Wu JT,AstillM E,Gagon SDetal.Measurement of c-erbB-2 proteins in sera from patientswith carcinomasand in breast tumortissue cytosols:correlation with serum tumormarkersandmembrane-bound oncoprotein[J].J Clin Lab Anal,1995;9（3）:151-165.

[收稿2010-03-08 修回2010-08-25]

（編輯 許四平）

Methological evaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patientsw ith the assay of antibodymembrane technique

YUXiu-Yan,ZENGChang-Qian,LIUXiao-Feng.CancerHospitalofJilinProvince,Changchun130012,China

Objective:To establish and evaluate for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients with antibody membrane technique.Methods:SeralC-erbB-2 protein was detected with antibodymembrane technique.The expression of C-erbB-2 protein in breast tissue was detectedwith immunohistochemical technique.Results:The positive rates of C-erbB-2 protein in sera of 30 breast cancer,26 breast proliferation patients and 30 normal controlswere40.0%,7.7%and 6.7%respectively.There was obvious difference in seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients comparedwith those in breastproliferation patients and normal control（P＜0.05）.The positive rate of seral C-erbB-2 protein in C-erbB-2 positive breast tissue and C-erbB-2 negative tissuewere 91.67%and 11.11%respectively.There was a correlation between seral C-erbB-2 protein and expression of C-erbB-prote in breast tissue（P＜0.01）.The sensitivity,specificity and accuracy of seral C-erbB-2 protein breast cancerwere 40.0%,92.8%and 74.4%respectively.Conclusion:The antibodymembrane technique for seral C-erbB-2 protein accordswith pathologic diagnosis highly in dignosing breast cancer.In addition,themethod is easy and practical clinically.

C-erbB-2 protein;Breast cancer;Breastproliferation;Antibodymembrane technique

R446.61

A

1000-484X（2010）12-1130-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.017

①本文為長(zhǎng)春市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.03-205544）

②大連大學(xué)遼寧省生物有機(jī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連116622

于秀艷（1968年-）,女,主任技師,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:yuxiuyan1968@sohu.com;

及指導(dǎo)教師:曾常茜（1964年-）,女,教授,研究生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:zengchangqian@163.com。

·臨床免疫學(xué)·