張少強(qiáng) 李勝利 閆利英 李隨勤 李白芽 朱宏亮 鄭慶印

為了探討老年性聽力損失的內(nèi)耳組織和毛細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，常選擇一些具有快速老化和聽力損失的動物作為老年性聾研究的動物模型。C57BL/6J小鼠耳蝸毛細(xì)胞在成年的早期開始退變，隨年齡增長，毛細(xì)胞退變從耳蝸基底回快速向蝸頂擴(kuò)展，到26月齡時，幾乎整個耳蝸的外毛細(xì)胞和大部分的內(nèi)毛細(xì)胞喪失[1，2]，而BALB/CByJ小鼠耳蝸功能從8月齡開始退變，此點(diǎn)符合感音性老年性聽力損失的特點(diǎn)，但其毛細(xì)胞和聽功能的退變較NMF308小鼠晚，到6月齡才開始出現(xiàn)聽力損失。另一種具有快速漸進(jìn)性年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss, AHL)的小鼠是Fischer 344 (F344)小鼠，相對于C57BL/6J小鼠而言，它的毛細(xì)胞喪失相對少一些[2]。本實(shí)驗(yàn)動物用美國西儲地大學(xué)(Case Western Reserve University, Cleveland)的NMF308小鼠，它是由乙?；鶃喯趸?N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)而來的神經(jīng)科學(xué)誘變基金(Neuroscience Mutagenesis Facility, NMF)產(chǎn)生的突變鼠，來源于杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Lab,Bar Habor),表現(xiàn)出快速漸進(jìn)性聽力損失，命名為NMF308nmf/nmf, 可作為年齡相關(guān)性聽力損失的動物模型。本研究旨在通過觀察NMF308nmf/nmf小鼠耳蝸毛細(xì)胞的死亡方式，探討老年性聾的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)選用28、30和60天齡的NMF308nmf/nmf小鼠各7只；用年齡相配的同窩7只C57BL/6J、BALB/CByJ小鼠作為對照組動物。

1.2ABR、DPOAE檢測 用美國Inteligent Hearing Smart聽覺誘發(fā)電位—耳聲發(fā)射儀測定ABR閾值和DPOAE幅值。ABR測試：動物用Avertin 0.5 mg/g麻醉后，用針形電極插入顱頂為記錄電極，同側(cè)乳突部位為參考電極，對側(cè)接地。刺激率19.1次/秒,高通300 Hz，低通3 000 Hz，平均疊加256～512次，以波Ⅲ峰出現(xiàn)為標(biāo)志判斷ABR反應(yīng)閾值。DPOAE測試：初始音強(qiáng)度分別為L1=70 dB SPL，L2=70 dB SPL的純音信號刺激，f1/f2=1.22，f1、f2的幾何均數(shù)的范圍位于0.5～8.0 kHz。分別選擇f2為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、32 kHz各點(diǎn)進(jìn)行測試，測量不同刺激強(qiáng)度時DPOAE的幅值，以引出反應(yīng)幅值高出本底噪聲3 dB時的最小刺激強(qiáng)度作為DPOAE有無的指標(biāo)，確定檢出率。上述測試均疊加100次。

1.3耳蝸鋪片及毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組動物測定ABR、DPOAE后，在麻醉狀態(tài)下，快速斷頭，迅速取出聽泡，分離出耳蝸，在解剖顯微鏡下，用纖細(xì)鋼針在耳蝸尖頂鉆一小孔，將前庭膜挑破，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并在耳蝸底回骨隆起處鉆一小孔，看到外淋巴液溢出后，馬上用細(xì)的滴管吸取1.0%的硝酸銀溶液，從蝸尖的小孔和兩窗及底回的小孔反復(fù)灌入。用雙蒸餾水洗滌數(shù)次，再灌入10%的福爾馬林固定液。在日光下曝光2～4小時。在解剖顯微鏡下分離鋪片，對鋪片完整的樣品參照以前的方法[3]進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4TUNEL和PI標(biāo)記方法 耳蝸樣品快速用4%多聚甲醛固定，4℃冰箱過夜。在解剖顯微鏡下，耳蝸置于中性磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)中，將Corti器完整取出，置于0.5% Triton X-100室溫孵育15 min；PBS洗兩遍。加100 μl TUNEL 反應(yīng)混合液(dUTP和TdT)于Corti 器管中，在37℃避光的暗盒中孵育60分鐘；隨后，洗滌兩次，再置于PI染色液中 (2～5 μg/ml Propidium iodine PI in PBS) 室溫共30 min；最后，Corti 器分回平鋪于載玻片上，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5Caspase - 3 免疫組織化學(xué)染色 耳蝸組織切片常規(guī)脫蠟至水,3 % H2O2孵育10 min ,蒸餾水沖洗。滴加抗原修復(fù)液1～3 滴,孵育10 min ,蒸餾水沖洗。10 %正常羊血清封閉20 min ; 滴加兔多抗Caspase - 3 抗體(1 :200) ,4 ℃過夜(對照組用正常羊血清代替一抗) ;加生物素標(biāo)記二抗,37 ℃孵育30 min ;PBS 漂洗三次,滴加SABC 反應(yīng)液1～2 滴,37 ℃DAB 顯色;蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,透明、封片,顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察照相。Caspase - 3 染色陽性結(jié)果表現(xiàn)為胞漿中有綠色顆粒分布。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0 for Window軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1ABR閾值變化 NMF308nmf/nmf突變鼠在發(fā)育到25天前聽功能正常；到30天齡時高頻(16、32 kHz)ABR閾值升高到50～60 dB SPL;到60天齡時，各頻率ABR閾值提高至60～70 dB SPL; 生長到90天齡時，各頻率ABR閾值提高到80～100 dB SPL，已達(dá)到重度聽力損失，而對照組C57BL/6J、BALB/CByJ小鼠到6～8月齡時，才出現(xiàn)聽力損失(圖1)。

圖1 ABR檢測結(jié)果

上圖為NMF308突變鼠不同刺激聲ABR閾值；下圖為NMF308、C57BL/6J和BALB/CByJ小鼠各月齡段32 kHz ABR閾值

2.2DPOAE變化 NMF308nmf/nmf小鼠1月齡時(29 d)，DPOAE幅值從15 009 Hz處開始下降，到19 609 至21 649 Hz降到最低；在2月齡時(60 d), DPOAE幅值從8 044 Hz開始下降，到15 909至21 649 Hz 降到最低，說明耳蝸OHC的功能喪失。而對照組C57BL/6J、BALB/CByJ3月齡的小鼠DPOAE幅值在正常水平(圖2)。

圖2 NMF308突變鼠DPOAE幅值變化

2.3耳蝸外毛細(xì)胞計(jì)數(shù) NMF308nmf/nmf突變鼠1月齡時耳蝸底回外毛細(xì)胞散在性缺失，2月齡時耳蝸底回80%OHC喪失，到3月齡時OHC的缺失已擴(kuò)展至中回的50%，4月齡時，耳蝸中回和底回的OHC幾乎完全喪失(圖3、4)。而對照組C57BL/6J小鼠到5月齡、BALB/CByJ小鼠到8月齡時才出現(xiàn)大量的毛細(xì)胞缺失。

圖3 NMF308突變鼠耳蝸外毛細(xì)胞喪失變化

2.4OHC的TUNEL和PI標(biāo)記 NMF308nmf/nmf突變鼠2月齡時耳蝸底回可見散在TUNEL陽性標(biāo)記的OHC，TUNEL陽性標(biāo)記的OHC核呈圓型，未見OHC核固縮細(xì)胞碎片，說明此時是毛細(xì)胞凋亡的早期階段(圖5)；3月齡時OHC的缺失十分嚴(yán)重，可見PI標(biāo)記的核固縮和細(xì)胞碎片出現(xiàn)，同時TUNEL陽性標(biāo)記的OHC亦十分明顯，是毛細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)(圖6)，對照組無陽性標(biāo)記。

2.5Caspase-3 激活標(biāo)記 NMF308nmf/nmf突變鼠2月齡時，激光共聚焦觀察Caspase-3的激活在耳蝸基底回OHC表現(xiàn)非常明顯，主要出現(xiàn)在OHC的胞漿上，并有散在的OHC缺失，內(nèi)毛細(xì)胞未見Caspase-的激活標(biāo)記(圖7)。對照組無陽性標(biāo)記。

3 討論

Noben-Trauth等[4]證明C57BL/6J、BALB/cByJ和WB/ReJ小鼠是最易發(fā)生AHL的小鼠；Jimenez等[5]通過測定C57BL/6J、BALB/CByJ小鼠的DPOAE，發(fā)現(xiàn)5～8個月齡時其耳蝸功能異常，故本實(shí)驗(yàn)以這兩種小鼠作為對照組動物。而本實(shí)驗(yàn)選擇的NMF308小鼠，其特點(diǎn)是從1月齡起出現(xiàn)聽功能損失，比上述研究者應(yīng)用的小鼠發(fā)生老年性聽力損失更早。文中ABR閾值檢測和耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示該種鼠呈快速漸進(jìn)性聽力損失和毛細(xì)胞缺失。DPOAE檢測結(jié)果表明NMF308nmf/nmf小鼠隨年齡增加，耳蝸外毛細(xì)胞功能喪失，耳蝸毛細(xì)胞表現(xiàn)為較廣泛的凋亡前改變，用TUNEL標(biāo)記耳蝸見外毛細(xì)胞普遍染色，而凋亡的后期表現(xiàn)不明顯，但毛細(xì)胞壞死的現(xiàn)象甚少，說明NMF308nmf/nmf小鼠用于老年性聾的動物模型具有更快速和省時的優(yōu)點(diǎn)。

Caspase激活是哺乳類動物耳蝸毛細(xì)胞死亡的重要分子途徑。Caspase-3在老年豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈陽性表達(dá),提示Caspase-3在豚鼠耳蝸老化過程中起重要作用[6]。目前普遍認(rèn)為，老年性聾的發(fā)病與多基因的改變和環(huán)境因素如噪聲、耳毒性藥物、疾病等密切相關(guān)。mtDNA突變鼠在6～10月齡出現(xiàn)漸進(jìn)性聽力損害，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞漸進(jìn)性凋亡，耳蝸核有明顯加速的漸進(jìn)性退變，在生理和病理組織形態(tài)上與人類老年性聾的聽覺系統(tǒng)具有相似的病理機(jī)制[7]。Liu 等[8]報導(dǎo)，在Caspase-3 水平阻斷細(xì)胞凋亡的通路可以有效地保護(hù)神經(jīng)元和毛細(xì)胞。因此，可以考慮設(shè)計(jì)以Caspase - 3 為靶標(biāo)的治療方案，從而阻斷細(xì)胞凋亡的通路，達(dá)到保護(hù)毛細(xì)胞和神經(jīng)元的目的，也許能為治療噪聲性聾開辟一條新的治療途徑。雖然缺乏Caspase抑制劑在老年性聾防治方面的研究，但從目前的發(fā)展趨勢來看，阻斷或抑制內(nèi)耳組織細(xì)胞凋亡和壞死的信號途徑，是防治老年性聾較科學(xué)的研究方向[9]。

本研究中，TUNEL陽性染色和Caspase-3標(biāo)記凋亡毛細(xì)胞在時間和空間上不完全同步出現(xiàn)，說明凋亡的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是一個動態(tài)過程。DNA 熒光標(biāo)記結(jié)果顯示[10]，老年大鼠耳蝸基底膜存在典型的凋亡和壞死特征的毛細(xì)胞核，表明老年大鼠耳蝸毛細(xì)胞死亡有凋亡和壞死兩種途徑，凋亡、壞死和缺失的毛細(xì)胞主要存在于老年大鼠耳蝸基底膜的頂回和底回，且第3 排外毛細(xì)胞損傷較嚴(yán)重，而在老年大鼠耳蝸基底膜中未見到大量的外毛細(xì)胞核，表明老年耳蝸毛細(xì)胞凋亡與噪聲性毛細(xì)胞凋亡有著截然不同的時空變化特點(diǎn)。老年耳蝸毛細(xì)胞凋亡是一個緩慢、非一致性的改變過程[10]，而噪聲性毛細(xì)胞凋亡則是急進(jìn)、具有相對核變化規(guī)律的形態(tài)學(xué)改變過程。本研究中，NMF308nmf/nmf小鼠在2月齡時才出現(xiàn)Caspase-3標(biāo)記凋亡的OHC(圖7)。

圖4 NMF308突變鼠1、2、3月齡時耳蝸毛細(xì)胞喪失變化(硝酸銀染色×40)

圖5 NMF308突變鼠2月齡時OHC變化 耳蝸底回處OHC大量缺失，PI標(biāo)記可見許多OHC核固縮現(xiàn)象(箭頭所指)

圖6 NMF308突變鼠3月齡時OHC變化OHC缺失十分嚴(yán)重，可見PI標(biāo)記的核固縮和細(xì)胞碎片出現(xiàn)，同時，TUNEL陽性標(biāo)記的OHC亦十分明顯，是毛細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)

圖7 NMF308突變鼠2月齡時Caspase-3的標(biāo)記激光共聚焦觀察Caspase-3的激活在耳蝸基底回OHC表現(xiàn)非常明顯，主要出現(xiàn)在OHC上，有散在的OHC缺失，內(nèi)毛細(xì)胞未見Caspase-3的激活標(biāo)記

單鏈DNA的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡早期的一種表現(xiàn)。細(xì)胞凋亡往往涉及單個細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。傳統(tǒng)上用顯微鏡觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。本實(shí)驗(yàn)NMF308nmf/nmf小鼠1月齡時，TUNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn)凋亡毛細(xì)胞核呈圓形，未見核固縮變形，說明此時是毛細(xì)胞凋亡的早期階段。Taylor[10]用TUNEL標(biāo)記卡那霉素?fù)p害7天的鼠耳蝸時也觀察到同樣的結(jié)果，但僅看到一個內(nèi)毛細(xì)胞呈現(xiàn)圓形的TUNEL陽性核，而Jiang[11]觀察到耳蝸底回有TUNEL標(biāo)記陽性的外毛細(xì)胞核固縮。Zheng[12]用TUNEL標(biāo)記老年耳蝸切片也出現(xiàn)陽性染色的圓形細(xì)胞核。噪聲損害耳蝸后，所有TUNEL陽性標(biāo)記細(xì)胞核固縮，表明這些凋亡的細(xì)胞里已經(jīng)發(fā)生DNA斷裂片段[13]。Cisplatin(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)損害Corti器的耳蝸鋪片可見TUNEL 標(biāo)記的內(nèi)外毛細(xì)胞核幾乎全部呈圓形[14]， 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相同(圖5)，僅在NMF308nmf/nmf鼠3月齡后觀察到TUNEL 陽性標(biāo)記與PI重染現(xiàn)象(圖6)，說明此時已是毛細(xì)胞凋亡的后期階段。研究表明，TUNEL與PI雙染可以確定TUNEL染色陽性的細(xì)胞為凋亡的細(xì)胞[15]。因此本研究結(jié)果表明，年齡相關(guān)性聽力損失小鼠耳蝸毛細(xì)胞的死亡機(jī)制是以DNA單鏈斷裂導(dǎo)致毛細(xì)胞核凋亡為主，隨后引起細(xì)胞漿Caspase-3激活，發(fā)生凋亡的串式連鎖反應(yīng)，使耳蝸毛細(xì)胞以凋亡形式死亡，從而導(dǎo)致老年性聾的發(fā)生。

(致謝：本研究得到美國Case Western Reserve University, Cleveland, 耳鼻喉-頭頸外科鄭慶印實(shí)驗(yàn)室提供的動物和實(shí)驗(yàn)幫助，特此致謝！)

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