徐金操 胡吟燕 徐延軍 孫建和 黃德亮 楊仕明

雖然前庭功能障礙有一系列不同的原因，但前庭毛細(xì)胞的缺失是前庭功能障礙的基本原因[1]。目前，相當(dāng)部分的前庭功能障礙是不可治愈的，而且，迄今為止，還沒有一種象助聽器、人工耳蝸一樣的人工裝置可以用來替代前庭功能的喪失[2]，臨床上也缺乏專門針對內(nèi)耳疾病的藥物。近來國外研究報道[3]，內(nèi)耳導(dǎo)入以腺病毒為載體的Math1(Ad-Math1)基因后，藥物性前庭功能障礙的小鼠出現(xiàn)了前庭毛細(xì)胞再生和功能的恢復(fù)，使通過基因?qū)胫委熐巴スδ苷系K成為可能。

腺病毒由于其轉(zhuǎn)染效率高的特點，是目前使用較多的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，但腺病毒本身對宿主細(xì)胞有損害作用，盡管現(xiàn)在已經(jīng)對其進(jìn)行了改良，然而目前關(guān)于其對動物內(nèi)耳毛細(xì)胞安全性方面的研究和報道不多。此外，Math1基因除可以誘導(dǎo)毛細(xì)胞增殖分化外，是否也會引起內(nèi)耳的不良反應(yīng)，也需要觀察。因此，本研究旨在探討Ad-Math1對內(nèi)耳毛細(xì)胞的安全性，為臨床前庭功能障礙基因治療的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 10只成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重250～300 g，健康活潑，無偏頭、步態(tài)不穩(wěn)、強(qiáng)迫環(huán)繞運動等前庭功能障礙表現(xiàn)。將10只大鼠分為正常對照組(n=5)、Ad- Math1-EGFP前庭階導(dǎo)入組(實驗組，n=5)。Ad- Math1-EGFP(由美國舊金山Genetech公司高維強(qiáng)教授惠贈，北京本元正陽基因技術(shù)有限公司擴(kuò)增純化)導(dǎo)入組大鼠在右耳通過耳蝸底回鼓階或前庭階打孔的方法導(dǎo)入物理滴度為2.1×1011v.p./ml的Ad- Math1-EGFP 5 μl(Ad- Math1的溶劑接近細(xì)胞外液)，對照組大鼠不做任何處理。

1.2前庭階導(dǎo)入方法 以新型獸用麻醉藥速眠新Ⅱ(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供)，按1 ml/kg的劑量麻醉大鼠后，頸部腹側(cè)徑路，暴露聽泡，以耳科電鉆磨去聽泡部分骨質(zhì)(位置應(yīng)靠后)，暴露前庭窗(可見鐙骨)，在前庭窗稍外上方(腹側(cè)觀)以自制纖細(xì)的鎢絲針(針尖外徑約0.1 mm)在耳蝸底回鉆開耳蝸骨壁進(jìn)入前庭階，鉆開后即可見清亮外淋巴液流出，通過最小刻度為0.1 μl的10 μl微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)連接自制微導(dǎo)管，通過TJ-1A型注射器泵控制器按0.5 μl/min的速度，將5 μl 物理滴度為2.1×1011v.p./ml的Ad-Math1-EGFP從前庭階打孔處緩慢注入耳蝸內(nèi)，注射完畢后，醫(yī)用耳腦膠將大小合適的肌肉塊封閉打孔處。用軟組織封閉聽泡骨壁缺損后，縫合手術(shù)切口。

1.3冰凍切片HE染色觀察 導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP 7天后，以速眠新Ⅱ麻醉大鼠，斷頭處死，迅速取出聽泡，浸泡在4%多聚甲醛中。剝離聽泡后，取出鐙骨，開放圓窗和前庭窗，蝸尖打孔，從蝸尖以4%多聚甲醛進(jìn)行灌注并在4℃冰箱中固定2小時，以10%EDTA脫鈣48小時后OCT包埋，進(jìn)行冰凍切片和HE染色，具體過程參照姜泗長等[4]主編的耳鼻咽喉科實驗技術(shù)。然后在Leica DMI 400 B倒置熒光顯微鏡(配置有Leica DMI400 B FX圖像采集系統(tǒng))下進(jìn)行觀察拍照。

1.4耳蝸及前庭組織Phalloidin染色激光共聚焦顯微鏡觀察 導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP 7天后，按上述方法，將耳蝸基底膜、球囊斑、橢圓囊斑、三個半規(guī)管壺腹嵴分別取出，用0.01 mol/L PBS清洗5分鐘3次后，放入0.3%Triton X-100(購自北京中杉金橋生物工程技術(shù)有限公司)浸泡10分鐘，PBS再次清洗5分鐘3次后，放入以PBS配制的1：40 Phalloidin-Tetramethylrhodamine(一抗已用紅色熒光標(biāo)記)中室溫下孵化30分鐘，以PBS充分洗滌后，固定于載玻片上，10%防熒光淬滅甘油封片，并在Zeiss AXIOVERT 200 M BP激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.5掃描電鏡觀察 將導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP 7天的大鼠麻醉處死后，按上述方法以2.5%戊二醛進(jìn)行灌注并在4℃冰箱中固定過夜，脫鈣一周后進(jìn)行大鼠前庭器官電鏡標(biāo)本的制作。具體過程參照姜泗長等[4]主編的耳鼻咽喉科實驗技術(shù)，并在Hitachi S4800掃描電鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.6游泳試驗 參照Staecker等[3]的方法，將大鼠從離水面約20 cm高處丟入直徑約1米、高度為50 cm的不透光并盛有與大鼠體溫接近的溫水的容器中，通過攝像機(jī)記錄大鼠從接觸水到出現(xiàn)有目的的游泳之間的時間。每只大鼠測量完后用暖風(fēng)機(jī)吹干并休息20分鐘后重復(fù)測量一次，取兩次的平均值。

1.7CDM-CEP的檢測 CDM-CEP是反應(yīng)球囊功能的前庭源性短聲誘發(fā)電位[5,6]，導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP 7天后，參照Matsuzaki[5]等的方法，動物麻醉后，行頸背部正中入路，暴露頸椎及頸嵴硬膜，將銀球電極置于第三頸椎水平頸嵴硬膜上，參考電極置于第一胸椎水平的背部脂肪墊。刺激條件：短聲(click)刺激，刺激頻率5 次/秒，疊加次數(shù)200次，帶通濾波30 ～3000 Hz，經(jīng)插入式耳機(jī)給聲，測試儀采用美國智聽(IHS)公司的Smart EP 誘發(fā)電位儀。每只動物測量兩次，取其平均值。

1.8ABR檢測 麻醉方法同前，將記錄電極固定于大鼠顱骨正中，參考電極固定于雙側(cè)耳垂。刺激條件：短聲(click)刺激，刺激頻率19.30 次/秒，疊加次數(shù)1 024次，帶通濾波30～3 000 Hz，經(jīng)插入式耳機(jī)給聲，測試儀采用美國智聽(IHS)公司的Smart EP 誘發(fā)電位儀。每只動物測量三次，以波V為準(zhǔn)確定閾值，取其平均值做為結(jié)果。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 游泳時間、CDM-CEP閾值、ABR閾值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以Excel表格儲存，以SPSS 10.0軟件采用方差分析進(jìn)行比較。部分圖像用Photoshop 8.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1冰凍切片HE染色觀察 對照組大鼠耳蝸Corti器內(nèi)毛細(xì)胞及外毛細(xì)胞均正常，球囊、橢圓囊及半規(guī)管壺腹嵴毛細(xì)胞及纖毛未見破壞，支持細(xì)胞、耳石膜存在；實驗組大鼠耳蝸Corti器、球囊斑、橢圓囊斑、半規(guī)管壺腹嵴在形態(tài)上表現(xiàn)與對照組大鼠基本一致，毛細(xì)胞及纖毛、支持細(xì)胞均正常(圖1)。

2.2Phalloidin染色觀察 正常大鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞及前庭囊斑毛細(xì)胞纖毛形態(tài)正常，表皮板、網(wǎng)狀表面及毛細(xì)胞相互之間的連接結(jié)構(gòu)清晰可見。實驗組耳蝸及前庭組織可見GFP的陽性表達(dá)明顯，與正常組相比，耳蝸及前庭結(jié)構(gòu)形態(tài)無明顯區(qū)別(圖2)。

2.3掃描電鏡觀察 正常對照組大鼠耳蝸基底膜內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞排列整齊，纖毛正常，球囊、橢圓囊耳石膜及半規(guī)管壺腹嵴終帽覆蓋良好，未見破壞，局部放大后可見耳石顆粒形態(tài)及壺腹嵴毛細(xì)胞纖毛正常；實驗組大鼠耳蝸基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞纖毛正常，橢圓囊耳石膜及半規(guī)管壺腹嵴終帽覆蓋良好，未見破壞，局部放大后可見耳石顆粒及毛細(xì)胞纖毛正常，球囊雖耳石膜缺失(標(biāo)本制作時所致)，但毛細(xì)胞纖毛排列均勻緊密，局部放大后，可見纖毛形態(tài)正常(圖3)。

圖1 對照組和實驗組大鼠耳蝸及前庭器官冰凍切片HE染色圖片

a～d為對照組大鼠，可見耳蝸Corti器(a)內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)及外毛細(xì)胞(OHC)均正常存在，球囊斑(b)、橢圓囊斑(c)及半規(guī)管壺腹嵴(d)毛細(xì)胞(HC)、纖毛(S)未見破壞，支持細(xì)胞(SC)、耳石膜存在(OM)；e～h為實驗組大鼠，耳蝸Corti器(e)、球囊斑(f)、橢圓囊斑(g)、半規(guī)管壺腹嵴(h)在形態(tài)上表現(xiàn)同對照組大鼠基本一致，毛細(xì)胞及纖毛、支持細(xì)胞均正常存在。以上圖片標(biāo)尺為25 μm

圖2 兩組大鼠耳蝸前庭組織鋪片phalloidin染色激光共聚焦顯微鏡觀察

a～c為正常對照組大鼠，可見耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)外毛細(xì)胞(OHC)(a)及前庭囊斑毛細(xì)胞(b、c)纖毛形態(tài)正常(白色箭頭所示)，表皮板、網(wǎng)狀表面及毛細(xì)胞相互之間的連接結(jié)構(gòu)清晰可見。d～f為實驗組大鼠，可見耳蝸基底膜(a)及前庭囊斑毛細(xì)胞(e、f)GFP表達(dá)明顯(藍(lán)色箭頭所示)，與正常組相比，耳蝸及前庭結(jié)構(gòu)形態(tài)無明顯區(qū)別。以上圖片標(biāo)尺均為10 μm(圖中e與b的染色差異為標(biāo)本處理過度所致)

圖3 兩組大鼠耳蝸前庭器官組織掃描電鏡圖片

a～d為正常對照組大鼠，可見耳蝸基底膜(a)內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)和三排外毛細(xì)胞(OHC)排列整齊，纖毛正常，球囊斑(b)、橢圓囊斑(c)耳石膜(箭頭所示)及半規(guī)管壺腹嵴終帽(d)(箭頭所示)覆蓋良好，未見破壞；e～h為實驗組大鼠，可見耳蝸基底膜(e)、內(nèi)外毛細(xì)胞纖毛正常，橢圓囊斑(g)耳石膜(箭頭所示)及半規(guī)管壺腹嵴終帽(h)(箭頭所示)覆蓋良好，未見破壞。球囊斑(f)雖耳石膜缺失，但毛細(xì)胞纖毛排列均勻緊密(箭頭所示)，纖毛形態(tài)正常。以上標(biāo)尺1(a、e)為2.5 μm，標(biāo)尺2(b～d,f～h)為25 μm，標(biāo)尺3(a～h右上角小圖)為4 μm

2.4功能方面 兩組大鼠游泳時間、CDM-CEP和ABR閾值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組動物的游泳時間、CDM-CEP閾值及ABR閾值

3 討論

目前，臨床上還沒有專門針對內(nèi)耳疾病的藥物，因此基因治療被應(yīng)用于耳毒性或內(nèi)耳缺血-再灌注損傷的動物模型中[7]，為內(nèi)耳疾病基因治療的臨床應(yīng)用進(jìn)行探索。將治療基因?qū)雰?nèi)耳并在靶器官上獲得良好的表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵所在。多種載體可以將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入內(nèi)耳，主要分為病毒和非病毒類載體，前者轉(zhuǎn)染效果好，但有一定的不良反應(yīng)；后者安全，但轉(zhuǎn)染效果低下[8]。

由于腺病毒(adenovirus，Adv)宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高、表達(dá)強(qiáng)度高的顯著優(yōu)點，該病毒成為目前運用最普遍的病毒載體之一[8]。研究證實腺病毒載體可以在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)毛細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[9,10]，但在內(nèi)耳引起的免疫反應(yīng)較明顯。新一代改良后的腺病毒載體，去掉了載體基因組中的E1/E3或E4片段，在新生大鼠的培養(yǎng)組織中證實可以轉(zhuǎn)導(dǎo)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[10]，而Luebke等[11]也證實新一代腺病毒載體(E1、E3缺失)在內(nèi)耳的耐受性要比老一代的腺病毒載體(未缺失E1、E3)更好，不良反應(yīng)小。Math1是哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育過程中所必需的一個基因[12]，已有研究證實，敲除了Math1基因的小鼠，聽覺和前庭毛細(xì)胞都沒有發(fā)育，而在體外培養(yǎng)的Corti器中加入以質(zhì)粒為載體的Math1基因后，產(chǎn)生了額外的毛細(xì)胞[12,13]。用Math1在人類中的同源基因Hath1，同樣重復(fù)出了上述結(jié)果[14]，因此，Math1是目前前庭功能障礙潛在的治療基因，但Math1基因的應(yīng)用是否對內(nèi)耳有不良的影響，目前尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，通過前庭階導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP(E1、E3缺失)一周后，實驗組大鼠的CDM-CEP、ABR閾值和游泳時間與正常大鼠相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而且大鼠前庭組織鋪片Phalloidin染色、冰凍切片HE染色及掃描電鏡觀察可見導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP 7天后，耳蝸前庭毛細(xì)胞均未受到損害，與正常對照大鼠相比，組織形態(tài)正常?？梢姳狙芯恐兴褂玫囊孕乱淮鷱?fù)制缺陷型腺病毒為載體的Math1基因?qū)η巴ズ投伱?xì)胞是安全的。此外，觀察到內(nèi)耳注入腺病毒一個月后，通過冰凍切片，在熒光顯微鏡下仍可見EGFP的表達(dá)，雖然其表達(dá)效率較低(資料未顯示)，但仍說明表達(dá)時間較長，而載體在動物體內(nèi)長時間表達(dá)，亦是基因治療有效性的一個保證[15,16]。

本研究證實，新一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體可以作為內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)導(dǎo)較理想的載體，經(jīng)前庭階耳蝸底回打孔導(dǎo)入以復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的Ad-Math1-EGFP，可以在前庭器官獲得良好的表達(dá)。

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