程友 黃金中 王秋萍 李澤卿 王天友 江滿杰 周玫

喉、氣管狹窄與缺損修復的關鍵是恢復喉、氣管軟骨支架及腔內黏膜上皮的完整性，但軟骨自我修復能力有限[1]，故其仍是目前臨床亟待解決的難題。組織工程化軟骨技術的發(fā)展為喉、氣管軟骨缺損的修復帶來了希望[2]；喉、氣管內的黏膜大面積缺損可通過移植肌皮瓣、裂層皮片等方式使其在體內逐漸上皮化實現(xiàn)功能修復[3，4]，但如何同時進行喉、氣管軟骨支架和腔內黏膜上皮的修復，尚未見報告。為此，本研究嘗試以聚丙交酯-乙交酯共聚物[poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA]包埋甲殼胺無紡布為細胞支架，用同種異體軟骨細胞在有免疫力的動物體內構建內襯上皮的管狀組織工程軟骨，為喉、氣管缺損的修復探索新方法。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑和材料 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(Sigma公司), 甲殼胺無紡布(海南欣龍公司，脫乙酰度：≥90%，分子量：20～50萬)，單體丙交酯(dl-LA)和乙交酯(GA)(中山大學高分子研究所)，PLGA包埋甲殼胺無紡布支架(孔隙率為82%～86%、孔徑為100～300 μm、剪切強度為48 MPa、厚度約為1.5 mm，與中山大學高分子研究所合作自行制備)。

1.2實驗方法

1.2.1兔耳廓軟骨細胞改良培養(yǎng)法(軟骨細胞懸液和軟骨塊共同培養(yǎng)法[5]) ①軟骨細胞的分離：無菌條件下取1月齡新西蘭大白兔耳廓軟骨，PBS液(含青霉素200 U/ml,鏈霉素200 μg/ml)漂洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，軟骨碎片置于10 ml離心管中，加入2倍體積的Ⅱ型膠原酶(0.3 mg/ml，Sigma公司)，37℃恒溫震蕩器內消化4～6 h，PBS液終止消化并漂洗2次,離心2 000 r/min×10 min，棄上清。②軟骨細胞的培養(yǎng)：200目銅篩網(wǎng)過濾，將離心所得的軟骨細胞與在篩網(wǎng)上未濾下的小片軟骨(約0.4 mm3大小)共同培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶預先用0.1%多聚賴氨酸預處理后干燥，先放入在篩網(wǎng)上取下的小軟骨塊，加入少量1640培養(yǎng)基(含150 g/L胎牛血清，50 mg/L 維生素C，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，292 mg/L谷氨酰胺,Sigma公司)，翻轉培養(yǎng)瓶培養(yǎng)1～2 h后，加入軟骨細胞，將細胞懸液和軟骨塊均勻分瓶，于37℃、50 ml/L的CO2及飽和濕度下共同培養(yǎng)。每天在相差顯微鏡下觀察軟骨細胞生長情況，3 d后第1次換液，以后每隔2 d換液1次。原代細胞貼壁并融合成單層時，2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，傳代培養(yǎng)。

1.2.2軟骨細胞/PLGA包埋甲殼胺無紡布支架復合物的構建 將PLGA包埋甲殼胺無紡布支架剪切成2.0 cm×2.5 cm大小的片狀，多聚賴氨酸中浸泡6 h；自然干燥，75%的乙醇中浸泡2 h，大量Hank's液沖洗3次，放入細胞瓶中用1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度下孵育24 h。植入細胞前2 h充分吸去其中的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中待用。收集第3～4代細胞，制成細胞懸液，調整軟骨細胞懸液密度達7.5×107個/ml，分別接種于支架材料上，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，2 d換液1次，體外培養(yǎng)7～10 d。

1.2.3人工軟骨培養(yǎng)物體內培養(yǎng)構建內襯上皮的管狀組織工程軟骨 實驗動物為12只4月齡新西蘭白兔(體重2.0～2.5 kg)，3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉動物后，無菌條件下在兔腹部行縱行平行皮膚切口，分離切口間皮下組織；將一有數(shù)十個側孔的長2.0 cm、外徑0.6～1.2 cm 硅膠管置皮膚表面，縫合兩切口內側皮膚邊緣制作內裹硅膠管的皮管；再將軟骨細胞支架復合物卷曲包裹于皮管上，4-0可吸收縫線縫合固定；最后，分離兩切口外側皮下組織及切口范圍內腹部肌肉至腹膜，將含軟骨細胞支架復合物的皮管包埋至腹肌深部(圖1)，拉攏、分層縫合。術后用青霉素80萬U肌注×3 d。

1.2.4染色及觀察方法 分別于術后6、12、18周各處死4只兔，取出包埋的移植物，觀察管狀組織工程軟骨是否形成及與皮管貼合情況，然后置于4%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，行HE染色(顯示軟骨細胞形態(tài)、軟骨細胞陷窩形成狀態(tài)及軟骨細胞與周圍組織關系)、甲苯胺藍染色(顯示胞體周圍軟骨基質)和Masson's染色(顯示膠原)，顯微鏡下觀察軟骨細胞成熟度及上皮層與軟骨貼合情況。

2 結果

2.1軟骨細胞體外培養(yǎng)相差顯微鏡下觀察 相差顯微鏡下見軟骨細胞以單個或群落狀吸附于支架纖維上；培養(yǎng)1周時支架纖維間有蜘蛛網(wǎng)狀基質產生。

2.2移植物觀察

2.2.1大體觀察 術后6周，軟骨細胞支架復合物基本保持植入前的形狀，管狀植入物外包裹一層粉紅色結締組織，去除結締組織后見標本呈乳白色，無血管分布，大小與植入前相當。12周時管狀組織工程軟骨基本形成，管狀植入物周圍有結締組織膜包繞，內面與皮管貼合緊密。18周時軟骨細胞支架復合物體積無明顯變化，去除包繞的結締組織膜，為管狀乳白色、有彈性的軟骨樣組織，內襯皮管(圖2)，管狀工程軟骨最長1.8 cm，最大內徑0.8 cm。

2.2.2組織學觀察 術后6周時復合物中有基質分泌，軟骨細胞不成熟，形狀多為橢圓形(圖3)。12周時,新生軟骨呈管狀，軟骨細胞接近成熟，可見軟骨陷窩，基質含量明顯增多(圖4)。18周時新生軟骨細胞呈圓形，軟骨陷窩明顯，細胞形態(tài)及基質含量與正常軟骨細胞無明顯區(qū)別，甲苯胺藍染色顯示胞體周圍有豐富的軟骨基質(圖5)；軟骨陷窩之間膠原綠色深染，顯示膠原含量豐富，上皮層與軟骨貼合緊密(圖6)。

3 討論

喉、氣管呈中空管狀，正常的纖毛黏膜上皮是防止分泌物潴留和瘢痕形成的關鍵，理想的移植物除了要有足夠的支撐作用和能夠長期體內留置外，還應有黏膜上皮覆蓋，目前臨床上常通過移植肌皮瓣、裂層皮片等方式使其在體內逐漸黏膜化從而完成功能修復。三維細胞支架在組織工程化軟骨的形成過程中起臨時的細胞外基質作用，為軟骨細胞提供附著、 增殖、 分化和代謝的場所[6，7]， 是組織工程化軟骨形成的關鍵[8]。理想的生物載體材料應具備良好的生物相容性和細胞界面、良好的降解吸收性和通透性、良好的可塑性和機械強度及三維立體結構[2]。呈中空管狀、足夠的機械強度和靈活的塑形性是喉、氣管軟骨對細胞培養(yǎng)支架的特殊要求。PLGA是由丙交酯和乙交酯按一定配比共聚所得到的一種新型高聚物材料，具有良好的抗張強度、生物相容性和降解性，目前在軟骨組織工程中應用較多[9，10]，但其脆性大、可塑性差；甲殼胺無紡布是以甲殼胺為原料，用先進的無紡技術制造出的新型高分子生物材料，本研究前期動物實驗已經(jīng)證明甲殼胺無紡布對生物體無毒性和炎癥反應，易于在體內降解吸收，降解吸收周期適宜且可以人為調控[11]，其可塑性好，但強度和抗張性能差。從文中結果看，利用這兩種材料的優(yōu)勢和特色，用PLGA包埋甲殼胺無紡布的新型聚合物支架制作方法[12]制作新型支架，其力學性能、可塑性、三維結構良好，孔隙率為82%～86%，孔徑為100～300 μm，種植于該支架的兔耳廓軟骨細胞貼壁、生長良好。因此該支架符合中空狀喉、氣管軟骨組織工程對細胞培養(yǎng)支架的特殊要求，在組織工程修復喉、氣管軟骨缺損的研究中將具有廣泛應用前景。

圖1將含軟骨細胞支架復合物的皮管包埋至腹肌深部

圖2 18周時，管狀組織工程軟骨形成，內襯皮管(箭頭所示)，硅膠管尚未取出

圖3 6周時，新生軟骨細胞欠成熟，形狀多為橢圓形，軟骨間有基質分泌(HE×40)

圖4 12周時,新生軟骨細胞接近成熟，可見軟骨陷窩，基質含量明顯增多(HE×40)

圖5 18周時，新生軟骨細胞完全成熟(左下角為兔耳廓軟骨細胞)，軟骨陷窩明顯，基質分泌旺盛，胞體周圍有豐富的軟骨基質(甲苯胺藍染色×100)

圖6 18周時，新生軟骨細胞完全成熟，軟骨陷窩明顯，軟骨陷窩之間膠原綠色深染，說明膠原含量豐富；上皮層(箭頭所示)與軟骨貼合緊密(Masson's染色×400)

Vacallti等[13]首先在裸鼠體內以聚乙交酯(PGA)無紡網(wǎng)為支架制備出管狀工程化軟骨。聚乙交酯(也稱聚羥基乙酸，PGA)、聚丙交酯(也稱聚乳酸，PLA)以及兩者的共聚物——聚丙交酯-乙交酯共聚物[Poly(DL-lactide-co-glycolide)，PLGA]具有良好的生物相容性、可降解吸收性，是目前組織工程研究中應用最為廣泛的一類材料，但這類材料在親水性、細胞粘附性、生物相容性、降解周期等生物學特性及機械性能等方面存在差別。本研究在有免疫力的動物體內選用PLGA包埋甲殼胺無紡布為支架材料構建出內襯上皮的管狀組織工程軟骨，接種子細胞后體外培養(yǎng)7～10 d植入體內，6周時復合物中有基質分泌，軟骨細胞不成熟；12周時新生軟骨細胞接近成熟，可見軟骨陷窩；18周時新生軟骨細胞形態(tài)以及基質含量與正常軟骨細胞無明顯區(qū)別，說明種子細胞接種至該新型支架后分布狀態(tài)良好，附著均勻，分泌基質旺盛，證實該新型支架是目前軟骨組織工程中比較合適的細胞三維生長支架材料，可以在體內形成軟骨組織。文獻報道體外軟骨細胞成熟的時間點不太一致，大多為16～18周，亦有報道為6～12周[14～18]，可能與軟骨取材部位、種植的軟骨細胞所處生長期、接種密度、所采用的三維支架、實驗動物、移植至動物體內的位置、各類軟骨細胞調節(jié)因子的影響等有關。

同種異體軟骨細胞作為種子細胞應用于組織工程中構建軟骨組織或器官，是目前最為關注的種子細胞之一。研究表明，同種異體軟骨細胞與PLGA包埋甲殼胺無紡布的細胞支架形成復合物植入體內后可形成組織工程化軟骨且不發(fā)生免疫排斥，這可能是由于軟骨組織本身免疫性較弱，且種子細胞經(jīng)過消化分離、體外培養(yǎng)和載體接種等過程后，其表面抗原受到削弱或破壞，從而減弱了其免疫原性[19]。隨著組織工程及相關技術和方法的不斷進展和日趨成熟，利用本實驗設計思路可構建人同種異體軟骨細胞內襯上皮的管狀組織工程軟骨，從而應用于喉、氣管缺損的臨床一期整體修復。

利用組織工程學的方法治療喉、氣管狹窄與缺損，理想的目標是復合工程化軟骨與工程化黏膜、黏膜下組織和工程化喉內肌肉等工程化組織實現(xiàn)在原位或異位同步形成具有軟骨、黏膜及其附隸肌肉的復合化喉、氣管組織工程器官。本研究僅是對此進行的一些初步探索，實驗中收獲的內襯上皮的管狀工程軟骨最大內徑為0.8 cm，更大管徑的實驗研究顯示新生軟骨形成不滿意，可能與種植于實驗動物的細胞支架復合物受動物體型較小、局部肌肉軟組織欠豐富及活動頻繁、局部未建立足夠有效滋養(yǎng)有關，具體機理尚待進一步探討。另外，獲取的組織工程化軟骨支撐強度、韌性、能量吸收效率和應力度能否達到或接近實際應用的要求，有待進一步研究。

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