黃秋紅 蔡小劍 張志鋼 劉翔 陳穗俊 鄭億慶

目前認(rèn)為分泌性中耳炎(OME)的病因主要有咽鼓管功能不良、感染(細(xì)胞生物膜機制[1])、免疫、神經(jīng)能性炎癥機制學(xué)說[2，3]，其中咽鼓管功能不良是主要原因[4]。咽鼓管功能不良繼發(fā)中耳通氣不足而引起缺氧狀態(tài)下的一系列病理生理改變，如細(xì)胞因子的分泌和離子通道的改變正日益引起人們的重視。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是1992年由Semenza等[5]在缺氧狀態(tài)下誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的一個核因子，被認(rèn)為是內(nèi)環(huán)境氧平衡和調(diào)節(jié)的核心[6]，其在低氧條件下可高度表達(dá)。本研究旨在檢測分泌性中耳炎模型動物中耳黏膜HIF-1α的表達(dá)，以探索其在分泌性中耳炎的病因及發(fā)病機理中的可能作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 取34只健康SD大鼠，雌雄不限，體重300～350 g，耳廓反射靈敏，鼓膜完整、呈白色、光錐清晰，聲導(dǎo)抗檢查雙耳鼓室導(dǎo)抗圖均為A型。以一側(cè)耳建立分泌性中耳炎模型為實驗組(34耳)；另一側(cè)耳不進行任何干預(yù)為對照組(34耳)。

1.2分泌性中耳炎動物模型的建立 根據(jù)Sade[7]、Kuijpers[8]、Javier[9]采用的電極熱凝及微波燒灼的方式進行改良，對實驗組各耳進行咽鼓管咽口化學(xué)燒灼。術(shù)前每只動物連續(xù)灌服復(fù)方新諾明(0.5 g/kg)三天，以3 mg/kg水合氯醛行腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定，取軟腭正中切口切開軟腭，0°或30°耳內(nèi)鏡下暴露咽鼓管咽口，以50%三氯醋酸燒灼一側(cè)咽鼓管咽口，軟腭切口不縫合，動物靜臥待其自行復(fù)蘇。術(shù)后以復(fù)方新諾明灌服，并用耳內(nèi)鏡定期觀察模型的建立情況。OME模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)：采用耳內(nèi)鏡動態(tài)觀察鼓膜內(nèi)陷、積液情況，金標(biāo)準(zhǔn)為打開聽泡后見鼓室內(nèi)積液。

1.3中耳黏膜中HIF-1α表達(dá)的檢測

1.3.1免疫組織化學(xué)法 分泌性中耳炎造模成功后，將大鼠斷頭處死，分別取出雙側(cè)聽泡，顯微鏡下以細(xì)勾針剝離出中耳黏膜，以4%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，分別進行HE染色、免疫組織化學(xué)染色。按SABC 免疫組化檢測HIF-1α(相關(guān)抗體及SABC 試劑盒均由武漢博士德生物技術(shù)公司提供),免疫組化步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。結(jié)果判斷：根據(jù)Gohji等[10]的評價標(biāo)準(zhǔn)，隨機選擇3個或5個高倍鏡視野(400倍)觀察，細(xì)胞顯色計分：A，細(xì)胞核、漿無顯色為0分(0)；B，胞核、漿呈淡黃色云霧狀為1分(+)；C，胞核、漿呈黃色顆粒狀為2分(++)；D，胞核、漿呈均勻深黃色為3分(+++)。計算每張切片中染色細(xì)胞顯色深淺(A、B、C、D)各占的百分比a、b、c、d，然后按A×a+B×b+C×c+D×d計算，以0分(-)、1分(+)為陰性、2分(++)為陽性，3分(+++)為強陽性。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 采用Trizol法提取總RNA。采用紫外吸收法進行RNA定量,各組樣品的RNA A260 /A280吸光度值均在1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：將所提取的總RNA采用分光光度儀測出其260 nmOD值后，采用濃度公式[RNA濃度=OD260 nm×40(稀釋倍數(shù))×40 μg·ml-1/1 000]計算總RNA濃度。同樣，取2 μgRNA進行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系20 μl，包括濃度為0.5 μg/μl的OligodT1 μl,5x M-MLV 緩沖液5 μl, 濃度為10 mmol/μl的dNTP2 μl, M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，RNA 酶抑制劑1 μl ，5×buffer 4 μl及DEPC 水，RT 的條件為: 70 ℃5 min , 37 ℃5 min , 42℃ 60 min , 72 ℃10 min。cDNA 產(chǎn)物置- 20 ℃保存。PCR擴增：根據(jù)Gene Bank中HIF-1α的mRNA序列用primerprimier5.0軟件設(shè)計引物并由上海生物工程公司合成，退火溫度為 55.7℃進行聚合酶鏈反應(yīng)，循環(huán)30次，以β-actin 基因作為內(nèi)參照進行PCR(具體步驟根據(jù)說明書所示)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，以凝膠成像系統(tǒng)顯示，再用Bandscan5.0凝膠掃描分析系統(tǒng)進行DNA電泳條帶灰度強度半定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包以方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較用配對樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1OME動物模型建模情況 34只大鼠中，21只(61.76%，21/34)于燒灼后的第一天出現(xiàn)鼓膜松弛部內(nèi)陷、充血，較術(shù)前增厚，質(zhì)地變韌，表面粗糙，緊張部無明顯變化；8只于術(shù)后第二天發(fā)生上述變化，3只鼓膜無明顯變化，2只麻醉時死亡；19只(55.88%，19/34)于術(shù)后第二、三天出現(xiàn)上鼓室內(nèi)陷持續(xù)，松弛部及緊張部前上及后上象限鼓膜內(nèi)表面粘附淡黃色粘稠分泌物，部分錘骨柄標(biāo)志欠清，鼓膜表面可見血管紋分布，8只于術(shù)后第四天出現(xiàn)上述變化，3只變化不大，2只第三天死亡；術(shù)后第四、五天，28只動物鼓膜完整，淡黃色分泌物在鼓膜內(nèi)表面分布的面積較前增大，血管紋較前減少，2只鼓膜穿孔，剔除。28只動物術(shù)后第七天打開聽泡后，14只見鼓室內(nèi)多量清亮積液，造模成功，6只無明顯變化，8只鼓室內(nèi)見黃綠色膿性分泌物，故14只造模失敗，予以剔除。

2.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果 正常對照組中耳黏膜HIF-1αmRNA 表達(dá)的平均灰度對數(shù)值為5.297±0.697；實驗組HIF-1αmRNA表達(dá)水平升高，其平均灰度對數(shù)值為6.870±0.632,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖1)。

2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果 HIF-1α主要表達(dá)于胞核,胞漿也有表達(dá)。正常對照組HIF-1α有少量表達(dá)，陽性細(xì)胞所占百分比的計分為0.500±0.149，實驗組HIF-1α表達(dá)增加，其陽性細(xì)胞所占百分比的計分為1.530±0.337，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖2、3)。

圖1 兩組目的基因擴增后電泳條帶圖圖2 實驗組中耳黏膜HIF-1α的表達(dá)(SABC法×20)圖3 對照組中耳黏膜HIF-1α的表達(dá)(SABC法×20)

3 討論

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成的異源二聚體核轉(zhuǎn)錄因子,其中HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基和功能亞基，正常生理條件下在胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài)，在低氧條件下高度表達(dá)，是近年來研究的熱門因子。它涉及到炎癥滲出、血管增生、腫瘤在缺氧環(huán)境中的侵襲作用、能量代謝等各個方面，被認(rèn)為是內(nèi)環(huán)境氧平衡和調(diào)節(jié)的核心。它在缺氧條件下，廣泛參與細(xì)胞對缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種應(yīng)答,促進血管生成、紅細(xì)胞生成、促進葡萄糖轉(zhuǎn)運及糖酵解增加等。

當(dāng)咽鼓管功能不良或機械性阻塞時，中耳腔內(nèi)的空氣被吸收后得不到相應(yīng)的補充，使中耳腔形成負(fù)壓，導(dǎo)致中耳黏膜毛細(xì)血管通透性增加，漿液漏出,形成中耳腔積液，隨著研究的深入，通氣不良導(dǎo)致的中耳腔的缺氧環(huán)境已逐漸得到證實[11]，而缺氧環(huán)境下產(chǎn)生的缺氧誘導(dǎo)因子誘發(fā)一系列缺氧反應(yīng)所介導(dǎo)的細(xì)胞因子活性上調(diào)，其中包括血管內(nèi)皮生長因子、白介素-2和6、腫瘤壞死因子等并由此引起Na+-K+-ATP酶活性的下調(diào)，導(dǎo)致水平衡失調(diào)引起中耳積液[12～14]。但在中耳通氣不良引起分泌性中耳炎的發(fā)生、發(fā)展中，HIF-1的表達(dá)情況如何及和其它因子的關(guān)系尚未見相關(guān)的報道。

文中結(jié)果表明實驗組HIF-1αmRNA表達(dá)明顯高于正常對照組，提示由于咽鼓管的破壞導(dǎo)致中耳通氣不良引起的分泌性中耳炎，可誘導(dǎo)缺氧細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，而HIF-1本身是一種細(xì)胞因子的調(diào)控基因，可引起Na+-K+-ATP酶功能障礙導(dǎo)致中耳積液，進一步導(dǎo)致聽力下降[15]。目前有關(guān)分泌性中耳炎和HIF-1之間的直接關(guān)系的基礎(chǔ)研究尚不多，HIF-1α如何通過影響各細(xì)胞因子而引起Na+-K+-ATP酶活性下調(diào)從而導(dǎo)致中耳積液的研究尚無報道，結(jié)合中耳腔的缺氧環(huán)境，研究細(xì)胞因子在分泌性中耳炎的發(fā)病機制和HIF-1與細(xì)胞因子之間的相互作用以及HIF-1在缺氧疾病中的核心作用，是今后的研究內(nèi)容之一，將有助于認(rèn)識HIF-1在分泌性中耳炎中的作用及機制，為中耳炎的預(yù)防和治療提供新的方向和思路。

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