薛 明,楊 諦,李 任

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科,遼寧沈陽(yáng) 110002)

骨組織吸收是根尖周病變和牙周病變中一個(gè)重要的病理改變,其治療的最終目的是誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖,分泌基質(zhì)從而礦化為骨組織,使缺失的牙槽骨重建。成骨細(xì)胞的增殖受多種因素相互作用的影響,包括激素、細(xì)胞因子和局部生長(zhǎng)因子等,這些因素的存在能夠影響骨組織的形成和礦化[1]。本實(shí)驗(yàn)研究白介素-2(Interleukin-2, IL-2)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響,探討影響成骨細(xì)胞增殖的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

MG63人骨肉瘤細(xì)胞系(中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)

胞中心);DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó));胎牛血清(天津?yàn)笊镏破?;胰蛋白酶(Amresco,美國(guó));白介素-2(長(zhǎng)春長(zhǎng)生基因,20萬(wàn)國(guó)際單位/支,批號(hào)20070806);腫瘤壞死因子-α(上海賽達(dá)生物藥業(yè),500萬(wàn)國(guó)際單位/瓶,批號(hào)20090612)。

1.2 方法

1.2.1 MG63細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的MG-63細(xì)胞,迅速放入37℃溫水中,輕輕搖動(dòng)凍存管令其內(nèi)容物盡快融化。用吸管吸出細(xì)胞懸液至離心管,加入新鮮培養(yǎng)基10 mL,輕吹懸浮細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,去上清,再用培養(yǎng)液重復(fù)洗1次。將MG-63細(xì)胞以5×105個(gè)/mL密度接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于含5%CO2、37℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,至覆蓋培養(yǎng)瓶底80%時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化,進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖的測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、幾乎長(zhǎng)滿瓶底的MG63細(xì)胞進(jìn)行傳代,制備成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,分為1個(gè)對(duì)照組和12個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,每孔100μL。37℃、5 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入100μL終濃度為5、10、50、100、500、1 000 U/mL的 IL-2和TNF-α,對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。各孔加入MTT 10μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)液,每孔各加入二甲基亞砜100μL,作用10 min后,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A570nm)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

隨著 IL-2劑量的增加,各組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖,以 IL-2濃度為100、500、1 000 U/mL組增殖明顯,與未加藥物的對(duì)照組比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。50～1 000 U/mL的TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞的增殖也有促進(jìn)作用(P＜0.05),這種促進(jìn)作用的峰值在100 U/mL,見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組成骨細(xì)胞的平均吸光度值(A570nm)Table 1 The mean absorbency values of osteoblasts(A570nm)

圖1 不同濃度I L-2和TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of I L-2 and TNF-αon the proliferation of osteoblasts

3 討 論

骨組織的形成需要經(jīng)過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞、骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等一系列細(xì)胞的增殖、分化。成骨細(xì)胞作為骨形成細(xì)胞,在成骨過(guò)程中經(jīng)歷分裂增殖、分化成熟和基質(zhì)鈣化3個(gè)階段。研究表明,很多細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖活動(dòng),如白介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白介素6(Interleukin-6, IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor,FGF)等[2-3]。 IL-2是體內(nèi)一種重要的參與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子,目前的研究認(rèn)為其主要生物學(xué)作用是促進(jìn)T細(xì)胞增殖;維護(hù)整個(gè)NK細(xì)胞的活化、分化和增殖,調(diào)節(jié)NK細(xì)胞保持其自然殺傷力;誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和增殖;誘導(dǎo)淋巴因子活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生;促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化作用;以及與其他白介素等的協(xié)同作用,用于抗腫瘤、抗病毒感染、抗細(xì)菌感染以及提高免疫力的治療等[4]。 IL-2對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響研究較少,Reyes-Botella等[5]檢測(cè)到成骨細(xì)胞表達(dá) IL-2受體和CD25分子,推測(cè) IL-2對(duì)成骨細(xì)胞的行為可能存在影響。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的 IL-2作用于MG63細(xì)胞后,觀察到 IL-2能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,隨著 IL-2濃度的增加,這種促進(jìn)增殖作用呈上升趨勢(shì),提示IL-2是成骨細(xì)胞的一種促分裂原,推測(cè) IL-2通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,參與骨吸收疾病的骨組織重建過(guò)程。

在骨組織改建過(guò)程中,成骨細(xì)胞不僅參與成骨過(guò)程,也參與破骨細(xì)胞的骨吸收過(guò)程,是骨代謝的主要功能細(xì)胞[6]。骨組織改建受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),其中TNF-α被認(rèn)為是一種十分重要的破骨細(xì)胞激活因子,能夠刺激前祖細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞,并能夠間接刺激成熟的破骨細(xì)胞形成骨吸收陷窩,導(dǎo)致破骨細(xì)胞的骨吸收增強(qiáng)[7]。在正常人體液中,TNF-α的水平一般在100 ng/L,在婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病例以及2型糖尿病骨質(zhì)疏松病例中,TNF-α的水平有所升高,這些均提示TNF-α是促進(jìn)骨吸收的動(dòng)因[8-9]。關(guān)于TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞的作用,目前研究主要集中在TNF-α能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡[10]以及產(chǎn)生骨吸收因子前列腺素-2(Prostaglandin E2,PGE2)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)[11]等方面。本試驗(yàn)將小劑量的TNF-α作用于成骨細(xì)胞,觀測(cè)到其對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用,并且隨著TNF-α濃度的增加,這種促進(jìn)作用逐漸削弱。推測(cè)低濃度的TNF-α通過(guò)增加成骨細(xì)胞的數(shù)量,產(chǎn)生炎癥因子,參與破骨過(guò)程,而高濃度的TNF-α則通過(guò)直接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)骨吸收。通過(guò)對(duì)骨組織改建過(guò)程中細(xì)胞因子作用的探討,可以為人為干預(yù)骨組織改建提供方向,從而提高炎性骨吸收疾病的治療水平。

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