何偉 王冬青 孫維斌 蘇兆亮 王錚超 許云飛

·論著·

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振監(jiān)測(cè)

何偉 王冬青 孫維斌 蘇兆亮 王錚超 許云飛

目的建立一種穩(wěn)定的人胰腺癌裸小鼠原位移植瘤模型，并探討無創(chuàng)的磁共振(MRI)對(duì)其監(jiān)測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。方法人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1體外常規(guī)傳代后建立裸鼠皮下種植瘤模型，將皮下種植瘤制成細(xì)胞懸液，植入20只BALB/C-nu裸鼠的胰腺包膜下構(gòu)建人胰腺癌原位移植模型；通過MRI檢查監(jiān)測(cè)模型的成瘤率、成瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤形態(tài)、信號(hào)變化等特征，于第7周末取腫瘤組織行病理學(xué)檢查。結(jié)果接種后15 d，7只(35%)荷瘤鼠在MRI上顯示成瘤，至接種后27 d，成瘤率為100%。腫瘤信號(hào)與鄰近組織相比，90%(18/20)病灶T1WI呈均勻稍低信號(hào)，10%(2/20)呈等信號(hào)；75%(15/20)在T2WI呈均勻高信號(hào)。移植后2、3、4、5、6、7周經(jīng)MRI測(cè)量的移植瘤體積分別為(12.6±2.4)mm3、(94.3±11.2)mm3、(175.9±82.5)mm3、(395.8±126.6)mm3、(1290.2±167.2)mm3、(1583.4±87.4)mm3。病理學(xué)檢查確診為胰腺低分化腺癌，并保持原發(fā)瘤的生物學(xué)特征。結(jié)論人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1移植瘤制成的細(xì)胞懸液種植裸小鼠胰腺包膜下制備胰腺癌模型符合人胰腺癌的特征，且易于無創(chuàng)監(jiān)測(cè)，為臨床研究提供了一個(gè)有效、穩(wěn)定的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體系。

胰腺腫瘤； 磁共振成像； 小鼠，裸； 腫瘤細(xì)胞系

早期發(fā)現(xiàn)并手術(shù)切除腫瘤是提高生存率的關(guān)鍵[1-3]，但臨床上很難完整觀察及研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)在裸鼠胰腺包膜下注入人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1懸液，旨在建立人胰腺癌裸小鼠胰腺原位移植瘤模型，為胰腺癌的臨床研究提供一個(gè)易于復(fù)制及便于監(jiān)測(cè)的腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)與裸鼠皮下瘤模型的建立

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所，體外常規(guī)傳代。BALB/C-nu裸小鼠25只，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雌性，4～6周齡，體重16～20 g，SPF級(jí)分籠飼養(yǎng)。其中5只裸鼠右肩部皮下種植PANC1細(xì)胞懸液建立皮下種植瘤模型。取一只腫瘤生長(zhǎng)較快的荷瘤鼠，在無菌條件下摘取皮下種植瘤研磨制成1×108/ml的細(xì)胞懸液。取50 μl細(xì)胞懸液注入胰尾下，在超凈臺(tái)內(nèi)20只裸鼠的胰腺包膜下。共移植。嚴(yán)格無菌。術(shù)后自由進(jìn)食飲水。

術(shù)后每日記錄裸鼠的一般狀況、手術(shù)并發(fā)癥，稱體重，肉眼觀察并觸診腫瘤的生長(zhǎng)狀況。

二、磁共振動(dòng)態(tài)檢查

應(yīng)用Siemens Magnetom Trio Tim 3.0T超導(dǎo)磁共振成像儀，使用臨床型乳腺線圈，對(duì)所有裸鼠術(shù)前行常規(guī)磁共振(MRI)檢查，術(shù)后第3天行MRI TSE序列T1WI、T2WI橫斷面、冠狀面及矢狀面掃描，掃描參數(shù)見表1。增強(qiáng)掃描采用TSE-T1WI-FS序列，此后每隔3 d復(fù)查一次，直至第7周處死裸鼠。由三位影像科醫(yī)師分別觀察并記錄腫瘤的部位、大小、形態(tài)、腫瘤信號(hào)及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等。在T2WI測(cè)量腫瘤的最大長(zhǎng)徑(L)、寬徑(W)和高徑(H)，按下列公式計(jì)算腫瘤體積V(mm3)。V=(4/3×π×L×W×H)×1/8[3]。

三、裸鼠原位瘤模型的病理學(xué)診斷

收集腫瘤原發(fā)灶及所有可能發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的臟器，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm厚度連續(xù)切片，行HE染色，常規(guī)光鏡檢查。

結(jié) 果

一、原位移植后荷瘤鼠瘤體生長(zhǎng)狀況

20只荷瘤鼠在2周內(nèi)進(jìn)食、進(jìn)水正常；3周后出現(xiàn)納差，活動(dòng)力減弱；5周后逐漸出現(xiàn)消瘦、皮膚干燥、惡病質(zhì)等生物學(xué)特性。接種后27 d 2只荷瘤鼠意外死亡。接種后第3天，處死2只荷瘤鼠觀察移植瘤的生長(zhǎng)。移植后荷瘤鼠1、2、3、4、5、6、7周的平均體重分別為19.7、20.1、20.0、19.2、18.9、18.5、17.6 g。

二、荷瘤鼠的MRI掃描所見

制模后第3天， MRI均顯示陰性結(jié)果。至15 d，7只(35%)荷瘤鼠的MRI顯示左腎前上方異常信號(hào)，病灶呈不規(guī)則形，境界清晰，最小瘤灶約2 mm×3 mm×4 mm。與周圍組織相比，T1WI呈不均勻稍低信號(hào)，T2WI呈均勻高信號(hào)(圖1A)，處死的2只荷瘤鼠的胰尾處形成不規(guī)則白色結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，無轉(zhuǎn)移灶。移植后27 d，MRI均顯示胰腺腫瘤，接種成功率為100%。腫瘤信號(hào)與鄰近組織相比，90%(18/20)T1WI呈均勻稍低信號(hào)，10%(2/20)呈等信號(hào)；75%(15/20)在T2WI呈均勻高信號(hào)，10%(2/20)以高信號(hào)為主，15%(3/20)呈等低信號(hào)；增強(qiáng)掃描瘤灶邊緣強(qiáng)化，中央不強(qiáng)化或輕度不均勻強(qiáng)化(圖1B、C)。移植后2、3、4、5、6、7周的瘤體積分別為(12.6±2.4) mm3、(94.3±11.2) mm3、(175.9±82.5) mm3、(395.8±126.6) mm3、(1290.2±167.2) mm3、(1583.4 ±87.4) mm3，中后期生長(zhǎng)較快。

表1 荷瘤裸鼠MRI平掃序列和參數(shù)

圖1同一動(dòng)物模型在癌細(xì)胞移植后15(A)、27 d(B)的MRI平掃和27 d增強(qiáng)掃描(C)的表現(xiàn)

三、荷瘤鼠的病理學(xué)檢查

術(shù)后27 d死亡的荷瘤鼠的胰腺腫瘤呈類圓形、分葉狀或結(jié)節(jié)狀，質(zhì)較硬，表面血管分布較少，瘤灶與周圍組織粘連，中心部位出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死腔(圖2A)。術(shù)后7周荷瘤鼠的腫瘤體積明顯增大，鄰近器官有轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)，未見明顯腹水。其中2只腹膜上有多個(gè)白色小結(jié)節(jié)形成，直徑在2～5 mm。

鏡下見腫瘤細(xì)胞排列成實(shí)性巢片狀結(jié)節(jié)，無腺腔，周圍可見正常胰腺細(xì)胞。后期瘤灶腫瘤細(xì)胞層數(shù)少，中央可見大片狀壞死；腫瘤細(xì)胞形態(tài)不一，呈多邊形或柱形，邊界清楚，胞質(zhì)淡染，胞核大而圓，染色深，異型性明顯，可見巨核、雙核，甚至奇異形核及病理性核分裂像，符合胰腺低分化腺癌(圖2B)。

圖2原位移植瘤大體表現(xiàn)(A)及病理變化(B,HE ×200)

討 論

評(píng)價(jià)一種模型主要根據(jù)它對(duì)人類疾病的生物學(xué)特征的復(fù)制程度[4]。人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1為惡性低分化腺癌，通過裸鼠皮下移植型、脾內(nèi)注射和原位移植為常用的動(dòng)物模型[5]。皮下接種簡(jiǎn)單易行，但移植瘤的生物學(xué)特性常同原發(fā)灶不同，如移植瘤常有包膜、呈局限性生長(zhǎng)、很少發(fā)生局部或遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移等，且由于受到位置的影響, 可能會(huì)產(chǎn)生藥物療效的假陽(yáng)性結(jié)果。脾內(nèi)注射胰腺癌細(xì)胞所致的動(dòng)物模型本質(zhì)上并非原位,而是異地發(fā)育或旁路侵襲，以上兩種模型均未能如實(shí)反映人胰腺癌形態(tài)及生物學(xué)特性。原位移植是將體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞或者外科手術(shù)中采集的胰腺癌組織移植到裸鼠的胰腺部位，能最大程度地表現(xiàn)和腫瘤轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)的細(xì)胞特性。異種原位移植最常用的途徑有瘤細(xì)胞懸液原位注射以及外科原位種植技術(shù)(SOI技術(shù))，即采用直接來自新鮮外科標(biāo)本或移植的人腫瘤組織, 通過原位種植于裸鼠體內(nèi)建立腫瘤模型，SOI技術(shù)在胃、肝臟及肺的原位腫瘤模型建立中應(yīng)用較多[6]，但由于其對(duì)外科技術(shù)要求高，在胰腺包膜下嵌插組織塊難度大，極易造成胰腺組織穿透、出血、胰漏以及組織塊脫落，引起嚴(yán)重的手術(shù)并發(fā)癥，造成裸鼠死亡或其它部位的種植。我們?cè)鴩L試使用原位種植方法建立模型，因組織塊脫落，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。后改用細(xì)胞懸液移植于裸鼠胰腺包膜下，在腫瘤細(xì)胞植入后15 d即可通過MRI無創(chuàng)監(jiān)測(cè)到腫瘤的形成，至第27天MRI顯示成瘤率為100%，與Zervox等[7]研究基本一致。移植后7周腫瘤的病理分析顯示腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、惡性生物學(xué)行為以及影像學(xué)表現(xiàn)均符合典型的人胰腺癌特征。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還嘗試在現(xiàn)有條件下使用高場(chǎng)強(qiáng)磁共振及臨床型線圈對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行無創(chuàng)監(jiān)測(cè)[8]，是一種敏感、可靠的檢測(cè)手段。本實(shí)驗(yàn)方法為更深入地研究胰腺癌發(fā)病機(jī)制、尋求新的治療手段、篩選新型抗腫瘤藥物等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供了較理想的荷瘤裸鼠模型與觀察方法。

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2009-02-12)

(本文編輯：屠振興)

EstablishmentandmagneticresonanceimagingmonitoringoftheorthotopictransplantationnudemousemodelwithhumanpancreaticcancercelllinePANC1

HE Wei, WANG Dong-qing, SUN Wei-bin, SU Zhao-liang, WANG Zheng-chao, XU Yun-fei.

Department of Radiology, Affiliated Hospital, Medical School, Jiangsu University, Zhenjiang 212001, China

WANGDong-qing,Emailwangdongqing71@hotmail.com

ObjectiveTo establish a stable orthotopic transplantation nude mouse model of the human pancreatic cancer and to explore the role of monitoring tumor growth with noninvasive MRI.MethodsThe tumors cells suspension made by the subcutaneous injection of human pancreatic cancer cell lines PANC1 were used as the source of tissue for orthotopic implantation of tissue,and transplanted into the pancreas of 20 BALB/C- nu nude mice. After implantation, the successful rate, tumor formation time, tumor growth speed, tumor shape and the change of signal of the tumor were monitored and recorded noninvasively by MRI. At the end of the 7th week, all the specimens were examined by pathological methods.ResultsThirty-five percent (7/20) mice with implantation of primary human PANC1 adenocarcinoma cells were detected to have orthotopic implanted tumors by MRI after 15 days, and all the 20 nude mice developed pancreatic tumor within 27 days after operations, and the successful rate was 100%. Compared with adjacent normal tissue, the T1WI imaging of 90% (18/20) of all the tumors showed uniformly hypo-intense signal, 10%(2/20) showed iso-intense signal, the T2W 75% (15/20) showed uniformly hyper-intense signal. The tumor size 2, 3, 4, 5, 6, 7 weeks after implantation was (912.6±2.4)mm3, (94.3±11.2)mm3, (175.9±82.5)mm3, (395.8±126.6)mm3, (1290.2±167.2)mm3, (1583.4±87.4)mm3, respectively. Pathologic examination confirmed poorly differentiated pancreatic adenocarcinoma and it remained the primary tumor′s biologic features.ConclusionsThe orthotopic transplantation nude mouse model was in accordance with the feature of human pancreatic cancer and was easy for noninvasive monitoring, which provided an effective and stable in vivo experimental system.

Pancreatic neoplasm; Magnetic resonance imaging; Mice, nude; Tumor cell line

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.013

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2006080)

212001 鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科 江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院影像系

王冬青，Email:wangdongqing71@hotmail.com