吳愷 徐剛 徐銘益 王興鵬

·論著·

干細胞因子在胰腺星狀細胞和肥大細胞黏附中的作用

吳愷 徐剛 徐銘益 王興鵬

目的觀察干細胞因子(SCF)在活化胰腺星狀細胞(PSC)中的表達以及在PSC與肥大細胞黏附中的作用。方法采用SD大鼠胰腺組織塊培養(yǎng)分離活化PSC，應用RT-PCR免疫細胞化學染色法檢測PSC的SCF mRNA和蛋白的表達；經(jīng)不同劑量的抗SCF抗體中和PSC表面SCF，采用β-氨基已糖苷酶測定觀察肥大細胞與PSC之間的黏附；PSC經(jīng)10 μg/ml絲裂霉素C處理后為飼養(yǎng)層細胞，與肥大細胞共培養(yǎng)，硫堇蘭染色觀察培養(yǎng)后2、3、5 d的肥大細胞生長情況。結(jié)果活化的PSC表達SCF mRNA和蛋白。對照組、1 mg/ml 和10 mg/ml抗體處理組黏附的肥大細胞量分別為每視野(48±10)個、(28±8)個和(23±9)個，抗體組較對照組明顯減少(Plt;0.05)。1 mg/ml 和10 mg/ml抗體組的肥大細胞黏附率分別為(53±3)%和(45±5)%。PSC和肥大細胞在無血清條件下共培養(yǎng)1 d后，PSC有肥大細胞黏附；共培養(yǎng)3 d后黏附的數(shù)量增加；5 d后呈堆積狀，有較多集落形成，PSC基本消失。結(jié)論活化的PSC可合成分泌SCF，引起肥大細胞的黏附和生長。

干細胞因子； 胰腺； 星形細胞； 肥大細胞

近年來研究發(fā)現(xiàn),肥大細胞不僅是Ⅰ型變態(tài)反應的主要免疫細胞，還參與慢性炎癥及纖維化的過程。在慢性胰腺炎胰腺纖維化組織中有胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell，PSC)的活化，同時肥大細胞數(shù)量明顯增加，并表現(xiàn)為特征性慢性脫顆粒[1]，但在胰腺纖維化過程中活化的PSC是否參與肥大細胞的趨化及生長尚不明了。干細胞因子(stem cell factor，SCF)是肥大細胞趨化和生長的必需因子。因此，本實驗觀察活化的PSC中SCF的表達以及對肥大細胞黏附和生長的影響。

材料與方法

一、肥大細胞

肥大細胞株(RBL-2H3)由本院檢驗科李莉主任惠贈，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，每3 d傳代一次。

二、胰腺星狀細胞分離

雄性SD大鼠，購自中科院動物中心，體重300 g左右。無菌條件下取胰腺組織，滅菌D-Hanks溶液漂洗去除血液后，剪成約1 mm3的小塊，平鋪于塑料培養(yǎng)皿中，先后滴加無菌大鼠血漿及氯化鈣，形成纖維包裹層，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液。2 d后見組織塊周圍有PSCs移出，待PSC達到一定數(shù)量后剔除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化傳代，3～6代PSC用于實驗。

三、SCF蛋白表達的檢測

采用細胞免疫化學法。PSC接種于玻璃爬片，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用冰冷無水甲醇固定20 min，PBS洗滌后滴加兔抗大鼠SCF多克隆抗體(1∶100，購自武漢博士德生物公司)4℃過夜，PBS洗滌后滴加即用型HRP標記二抗(長島生物技術公司)室溫孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復染后中性樹膠封片。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

四、SCF mRNA的檢測

采用RT-PCR方法。收集PSC細胞，采用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA，SCF引物序列為5′-GCT-ACCCAATGCTGGGACTA-3′和5′-GCCACGAGGTCA-TCCACTAT-3′，退火溫度為56℃，擴增片段為456 bp，以GAPDH為內(nèi)參照。擴增產(chǎn)物電泳后采用GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)進行觀察分析。

五、肥大細胞黏附實驗

PSC接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞長滿后充分洗滌，添加含1、10 mg/ml的SCF IgG的無血清培養(yǎng)基，對照組加入非免疫型IgG，每個濃度重復4孔。培養(yǎng)3 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入1×104肥大細胞，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后用無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌3次，去除未黏附的肥大細胞。隨機選取5個視野計數(shù)PSC細胞表面黏附的肥大細胞數(shù)量。

六、β-氨基己糖苷酶(β-hexasaminidase)測定

β-氨基己糖苷酶是肥大細胞中特有的酶類，其活性的高低反映肥大細胞的數(shù)量以及顆粒分泌的情況。參考文獻[2]方法檢測。同上述黏附實驗操作，以單純1×104肥大細胞作對照。用100 μl細胞裂解液裂解細胞，吸取25 μl細胞裂解液和100 μl 1.2 mmol/L的4-methyllumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminidase(溶于0.05 mol/L醋酸鈉溶液，pH4.4)于96孔板，37℃反應30 min，加入175 μl 0.1 mol/L甘氨酸-碳酸鹽緩沖液(pH10.0)，混勻后在熒光酶標儀檢測。激發(fā)波長為360 nm，淬滅波長為450 nm。肥大細胞黏附率=樣品管A值/對照組A值×100%。

七、PSC對肥大細胞生長影響的觀察

PSC接種于24孔培養(yǎng)板，待70%～80%細胞融合時加入10 μg/ml的絲裂霉素C，37℃孵育3 h，用PBS洗滌細胞6次充分洗去絲裂霉素C，制備PSC飼養(yǎng)層細胞。培養(yǎng)24 h后加入2×104肥大細胞，采用無血清化培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)后第2、3、5天用硫堇蘭染色，觀察肥大細胞(呈紫紅色)的生長情況。

八、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、活化PSC的SCF mRNA和蛋白的表達

分離培養(yǎng)的活化PSC細胞呈梭形，活化的PSC表達SCF mRNA和蛋白(圖1)。

圖1活化PSCs的SCF mRNA(A )和蛋白(B，免疫化學染色 ×200)表達

二、PSC和肥大細胞之間的黏附

鏡下肥大細胞呈圓形或橢圓形，散在黏附于PSC表面，對照組和1 mg/ml、10 mg/ml抗體組黏附的肥大細胞量分別為每視野(48±10)個、(28±8)個和(23±9)個，抗體組較對照組明顯減少(Plt;0.05)。β-氨基已糖苷糖酶測定的肥大細胞黏附率，1、10 mg/ml抗體組分別為(53±3)%、和(45±5)%。

三、PSC對肥大細胞生長的影響

肥大細胞在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后有大量細胞漂浮，只能維持存活2 d。經(jīng)絲裂霉素C處理后的PSC飼養(yǎng)層細胞，具有無法增殖、可維持細胞正常生理活性等特點，并在5～7 d后死亡消失。PSC和肥大細胞在無血清條件下共培養(yǎng)1 d后，PSC有肥大細胞黏附存活，培養(yǎng)液中有肥大細胞懸浮；3 d后黏附的肥大細胞數(shù)量增加，而PSC和懸浮的肥大細胞數(shù)量減少；5 d后肥大細胞呈堆積狀，有較多集落形成，PSC基本消失，僅有零星散在分布(圖2)。

圖2PSC和肥大細胞共培養(yǎng)1(A)、3(B)、5 d(C)的細胞生長情況(×100)

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞不僅參與局部的免疫反應，在慢性炎癥及組織纖維化中也發(fā)揮一定的作用，其顆粒成分諸如類胰蛋白酶(tryptase)、類糜蛋白酶(chymase)及肝素等均可刺激成纖維細胞和肝星狀細胞膠原合成增加，在肝臟、腎臟等組織纖維化中均有肥大細胞數(shù)量的增加且與纖維化程度呈正相關[3-4]。胰腺纖維化過程中主要效應細胞PSC的持續(xù)活化增殖是關鍵。在胰腺纖維化組織中有肥大細胞的聚集和慢性脫顆粒，且主要分布在PSC周圍，推測活化的PSC可能參與了肥大細胞的聚集和脫顆粒過程。

肥大細胞來源于骨髓，在外周血發(fā)育成熟并分布于臟器的間質(zhì)中，數(shù)量和分布相對穩(wěn)定。SCF是肥大細胞發(fā)育成熟以及組織趨化定位的主要介質(zhì)，通過與肥大細胞表面的SCF受體(c-kit)發(fā)揮生物學效應，SCF分為可溶性和膜結(jié)合型兩大類，可溶性SCF主要影響肥大細胞的成熟及趨化，而膜結(jié)合型參與細胞之間的黏附接觸。此外，肥大細胞胞膜表面有特異性生精免疫球蛋白超級家族(spermatogenic immunoglobulin superfamily, SgIGSF)表達。不表達c-Kit和SgIGSF的肥大細胞株IC-2轉(zhuǎn)染c-Kit和SgIGSF基因后，其與成纖維細胞的黏附量明顯高于單獨轉(zhuǎn)染c-Kit基因的細胞，而單獨轉(zhuǎn)染SgIGSF基因則黏附作用未見增強，提示SCF/c-Kit可能是肥大細胞黏附作用的主要啟動因素，對其他參與因素具有引導作用[5]。本實驗結(jié)果顯示，活化的PSC表達SCF mRNA和蛋白，經(jīng)抗SCF抗體中和后，肥大細胞黏附于PSC的數(shù)量明顯減少，在1 μg/ml以上抗體中和后，肥大細胞的黏附率維持在50%左右，呈現(xiàn)一個平臺期，提示除SCF/c-Kit系統(tǒng)外還存在其他黏附分子參與細胞間的黏附過程。

SCF對肥大細胞的生長具有重要意義。原代肥大細胞體外培養(yǎng)條件下無法長期存活，然而在SCF和IL-1持續(xù)刺激下可存活2～3周。Sellge等[6]在人腸道原代成纖維細胞(FB)和原代肥大細胞的共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，肥大細胞在FB存在的條件下可存活至3周，遠長于肥大細胞單獨培養(yǎng)條件下的3～4 d的存活時間，推測肥大細胞釋放的顆粒成分作用于FB產(chǎn)生SCF，SCF刺激肥大細胞的生長，形成相互刺激作用。本研究采用絲裂霉素C抑制PSC的生長，制備成飼養(yǎng)細胞，與肥大細胞共培養(yǎng)后，肥大細胞黏附于PSC并生長，推測胰腺纖維化過程中活化PSC表達的SCF誘導肥大細胞趨化黏附并生長，而肥大細胞的顆粒成分維持PSC的活化，加速纖維化的形成。

[1] 吳愷，張汝玲，王興鵬.肥大細胞在胰腺纖維化中的介導作用.胰腺病學,2003,3:129-131.

[2] Naal RM, Tabb J,Holowka D,et al.In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosen Bioelectron,2004,20:791-796.

[3] Armbrust T, Batusic D, Ringe B, et al. Mast cells distribution in human liver disease and experimental rat liver fibrosis. Indications for mast cell participation in development of liver fibrosis. J Hepatol, 1997,26:1042-1054.

[4] Otsubo S,Nitta K,Uchida K,et al.Mast cells and tubulointerstitial fibrosis in patients with ANCA-associated glomerulonephritis. Clin Exp Nephrol,2003,7:41-47.

[5] Koma Y,Ito A, Watabe K,et al.Distinct role for c-kit receptor tyrosine kinase and SgIGSF adhesion molecule in attachment of mast cells to fibroblasts.Lab Invest,2005,85:426-435.

[6] Sellge G,Lorentz A,Gebhardt T,et al.Human intestinal fibroblasts prevent apoptosis in human intestinal mast cells by a mechanism independent of stem cell factor, IL-3, IL-4, and nerve growth factor.J Immunol,2004,172: 260-267.

2008-12-01)

(本文編輯：呂芳萍)

Effectofonadhesionbetweenpancreaticstellatecellandmastcell

WU Kai, XU Gang, XU Ming-yi, WANG Xing-peng.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

WANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate stem cell factor (SCF) expression in activated pancreatic stellate cell (PSC) and the effect of SCF on adhesion between PSC and mast cell (MC).MethodsPSC of SD rat was separated and activated by pancreatic tissue culture; the expression of SCF mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunochemistry. SCF was blocked with different dose of anti-SCF antibody, the rate of adhesion between PSC and MC was determined by thionin blue stain and β-hexasaminidase assay. PSC was stimulated by 10 μg/ml mitomycin-C and was co-cultured with MC, then the growth of MC was observed at 2, 3, 5 day, respectively.ResultsActivated PSC expressed SCF mRNA and protein, the number of adhered MC in the control, 1 mg/ml and 10 mg/ml antibody groups was 48±10, 28±8, and 23±9, respectively; the difference between antibody and control group was statistically significant (Plt;0.05). One day after PSC and MC was co-cultured without serum, there were MC adhesion; 3 days later the rate of adhesion increased; 5 days later the adhesion appeared bulk-like and lots of colonies were present, while PSC basically disappeared.ConclusionsActivated PSC may synthesize, express SCF and induced adhesion and growth of MC.

Stem cell factor; Pancreas； Astrocytesl; Mast cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.010

上海市衛(wèi)生局課題資助(024016)

200080 上海，上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院消化科(吳愷、徐剛、徐銘益、王興鵬)；同濟大學附屬第十人民醫(yī)院(王興鵬)

王興鵬，Email: wangxp1965@yahoo.com.cn