施琳琳 孟立娜 葉咸德 趙承滿 包海標(biāo)

·論著·

重組腸三葉因子對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜保護(hù)作用的研究

施琳琳 孟立娜 葉咸德 趙承滿 包海標(biāo)

目的探討重組腸三葉因子(rITF)對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法SD雄性大鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、ANP組、rITF組，每組20只。逆行胰膽管注射5%牛黃膽酸鈉100 μl/100 g體重制備ANP模型。rITF組制模前后尾靜脈注射rITF 0.5 mg/100 g體重，對(duì)照組及ANP組注射等量生理鹽水，術(shù)后12、24 h分批處死大鼠。取血檢測(cè)淀粉酶含量，取末端回腸組織觀察病理學(xué)改變并予評(píng)分、免疫組化法檢測(cè)腸黏膜NF-κB活性，RT-PCR法檢測(cè)腸黏膜TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果ANP組和rITF組血淀粉酶水平較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組均顯著升高。ANP組腸黏膜損傷評(píng)分較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組高(Plt;0.05)；ANP 12 h組較rITF 12 h 組高(Plt;0.05)，但24 h組間評(píng)分無(wú)明顯差異。對(duì)照組、ANP組與rITF組12 h腸黏膜NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(26±4)個(gè)、(55±8)個(gè)、(49±4)個(gè)；回腸組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.050±0.005、1.040±0.031和0.792±0.0256；回腸組織ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.045±0.010、0.795±0.037和0.400±0.031。ANP組上述各項(xiàng)指標(biāo)值均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.05或Plt;0.01)，而rITF組又較ANP組均顯著減少(Plt;0.05)。結(jié)論重組腸三葉因子對(duì)ANP大鼠腸黏膜具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)抑制腸黏膜NF-κB活化，下調(diào)TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)。

胰腺炎，急性壞死性； 腸黏膜； 核因子-κB； 腸三葉因子

全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能衰竭(MOF)是重癥急性胰腺炎(SAP)患者病死的主要原因。腸道黏膜屏障受損可引發(fā)腸道細(xì)菌易位，繼發(fā)內(nèi)毒素血癥，造成二次打擊，最終導(dǎo)致SIRS及MOF的發(fā)生[1]。因此，防治腸黏膜屏障功能障礙是治療SAP的中心環(huán)節(jié)之一。腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)消化道黏膜具有保護(hù)作用的因子[2]。研究證實(shí)，SAP時(shí)腸黏膜屏障功能受損與NF-κB的活性密切相關(guān)。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察重組ITF(reorganized intestinal trefoil factor,rITF)對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

60只12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，體重(300±40)g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、ANP組和rITF組，各20只。后兩組參考Aho法[3]，膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉溶液100 μl/100 g體重制備ANP模型。對(duì)照組僅剖腹，翻動(dòng)胰腺。對(duì)照組及ANP組手術(shù)前后尾靜脈注射生理鹽水0.5 ml/100 g體重；rITF組注射rITF 5 mg/100 g體重(由北京大學(xué)蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。術(shù)后12、24 h分批處死大鼠，取血檢測(cè)淀粉酶含量(自動(dòng)生化分析儀測(cè)定)，取距回盲部10 cm左右的回腸組織備用。

二、腸道黏膜組織病理檢查

剪取末端回腸2 cm，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，參照Chiu等[4]方法將小腸黏膜損傷分為6級(jí)進(jìn)行評(píng)分。0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血；2分：上皮下間隙擴(kuò)大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細(xì)胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

三、腸黏膜NF-κB活性檢測(cè)

采用快捷免疫組化MaxVisionTM法，根據(jù)MaxvisionTM試劑盒(福州邁新公司)說(shuō)明書操作。兔抗鼠NF-κB p65亞單位一抗(Santa Cruz公司)1∶50稀釋。腸黏膜細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)棕褐色著色為陽(yáng)性細(xì)胞，單純胞質(zhì)棕褐色著色為陰性。高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)回腸橫斷面的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)。

四、回腸組織TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA檢測(cè)

用Trizol試劑(Invitogen 公司)抽提回腸組織總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)TNF-α mRNA、ICAM-1mRNA。先用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生物有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。TNF-α上游引物5′-CCACGTCGTAGCAAACCAC-3′，下游引物5′-TGGGTGAGGAGCACGTAGT-3′，擴(kuò)增片段189 bp；ICAM-1上游引物5′-GATGCTGACCCTGGAGAGCA-3′，下游引物5′-CAGGGACTTCCCATCCACCT-3′，擴(kuò)增片段409 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGGAAT-CCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物5′-TAA-AACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物349 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s，55℃(TNF-α)或60℃(ICAM-1)或58℃(β-actin)30 s，72℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后，利用GeneGenius凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。以目的產(chǎn)物條帶和β-actin條帶的光吸收值比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠生存率

對(duì)照組大鼠全部存活；rITF 12 h組和ANP 12 h組各死亡1只；rITF 24 h組和ANP 24 h組各死亡2只。同一時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠和不同時(shí)間點(diǎn)的同一組別大鼠死亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、大鼠血清淀粉酶變化

術(shù)后12 h，對(duì)照組、ANP組和rITF組血清淀粉酶分別為(723±135)U/L、(1905±286)U/L和(2836±521)U/L;24 h為(616±37)U/L、(2073±1092)U/L和(1562±755)U/L。ANP組和rITF組淀粉酶水平較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組均顯著升高(Plt;0.01)，而同時(shí)點(diǎn)rITF組與ANP組間無(wú)明顯差異。

三、回腸組織病理改變

對(duì)照組小腸無(wú)水腫及腸腔脹氣，鏡下見(jiàn)腸上皮絨毛完整，上皮細(xì)胞下無(wú)間隙，間質(zhì)僅少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；ANP組小腸腸壁水腫，腸腔脹氣呈管狀，腸周圍可見(jiàn)皂化斑，部分大鼠出現(xiàn)腹水，鏡下見(jiàn)腸道絨毛上皮細(xì)胞脫落、壞死，上皮下間隙擴(kuò)大，淋巴管擴(kuò)張明顯，伴有毛細(xì)血管充血，并可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；rITF組腸壁水腫不明顯，少見(jiàn)腸腔脹氣及皂化斑，鏡下見(jiàn)腸道絨毛上皮細(xì)胞壞死較少，毛細(xì)血管少量充血明顯，淋巴管擴(kuò)張不明顯，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1左)。ANP組腸黏膜損傷評(píng)分較同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組高(t=114.5、t=113.5，Plt;0.05，表1)；ANP 12 h組較rITF 12 h 組高(t=108.5，Plt;0.05)，24 h組間評(píng)分無(wú)明顯差異。

四、回腸黏膜NF-κB活性

術(shù)后12 h，對(duì)照組、ANP組和rITF組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(26±4)個(gè)、(55±8)個(gè)、(49±4)個(gè)；24 h分別為(37±9)個(gè)、(66±4)個(gè)、(40±9)個(gè)(圖1右)。ANP組較對(duì)照組明顯增加(Plt;0.01)，rITF組較ANP組明顯下降(Plt;0.05)。

五、回腸組織TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)及其與NF-κB相關(guān)性

術(shù)后12 h，對(duì)照組、ANP組和rITF組回腸組織TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.050±0.005、1.040±0.031和0.792±0.0256；24 h為0.049±0.007、1.73±0.132和0.918±0.0425(圖2)。術(shù)后12 h回腸組織ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.045±0.010、0.795±0.037和0.400±0.031；24 h為0.060±0.005、1.156±0.095和0.590±0.067(圖3)。ANP組TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加(Plt;0.05)，而rITF組又較ANP組明顯降低(Plt;0.05)?；啬c組織TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)均與NF-κB活性呈正相關(guān)(r=0.919，r=0.917，Plt;0.01)。

圖1(左) 對(duì)照組(A)、ANP組(B)、rITF組(C)12 h大鼠小腸黏膜病理學(xué)改變(HE ×200)；(右)對(duì)照組(A)、ANP組(B)、rITF組(C)12 h大鼠小腸黏膜NF-κB活化(免疫組化 ×40)

表1 各組大鼠腸黏膜損傷評(píng)分

圖2 各組大鼠腸黏膜TNF-α mRNA表達(dá)

圖3 各組大鼠腸黏膜ICAM-1 mRNA表達(dá)

討 論

SAP時(shí)，腸道組織不僅是被損傷的靶器官，更是應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和全身炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者。正常情況下，NF-κB處于抑制狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到炎癥因子(TNF-α、IL-1β等)、氧自由基、蛋白激酶C、病毒或細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等刺激時(shí)可激活NF-κB，NF-κB的活化又可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等)、ICAM-1、VCAM-1、白細(xì)胞黏附分子-1、趨化因子等表達(dá)增加。

TNF-α是NF-κB下游激活的重要細(xì)胞因子之一，是SAP并發(fā)多臟器損傷的始動(dòng)因子之一[5]。現(xiàn)已證實(shí)，TNF-α可改變腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，使其異常表達(dá)相關(guān)黏附因子和肌動(dòng)蛋白從而影響腸屏障通透性。ICAM-1在正常情況下低水平表達(dá)，但在SAP患者，血清ICAM-1含量明顯升高[6]，應(yīng)用外源性ICAM-1拮抗劑可減輕實(shí)驗(yàn)性ANP導(dǎo)致的肺損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠早期腸黏膜NF-κB即明顯活化，同時(shí)TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。

ITF由59個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為6700，屬三葉肽家族。ITF主要在腸道上皮細(xì)胞表達(dá)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被多種消化酶破壞，能抗酸、抗蛋白酶和抗熱分解，主要生理功能為保持腸道結(jié)構(gòu)及功能上的完整，對(duì)腸道黏膜的保護(hù)和修復(fù)起重要作用。研究表明[8]，ITF具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，可明顯減輕多種損傷因子介導(dǎo)的腸黏膜損害，它不僅具有一般生長(zhǎng)因子所具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖與移行的能力，還能同黏液糖蛋白結(jié)合，穩(wěn)定腸黏液層。因而ITF 在腸道的自我保護(hù)和損傷后修復(fù)機(jī)制中占重要地位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠靜脈給予外源性rITF干預(yù)后，黏膜損傷明顯減輕，腸上皮NF-κB的活化被明顯抑制，同時(shí)TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA的表達(dá)亦較ANP組明顯下降(P均lt;0.05)，表明rITF的干預(yù)除能增加腸道表面黏液保護(hù)層和提高上皮細(xì)胞遷移外，還可能通過(guò)抑制腸上皮NF-κB的活化，下調(diào)其介導(dǎo)的炎性介質(zhì)TNF-α和ICAM-1的過(guò)度表達(dá)，減輕級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)形成，從而起到保護(hù)ANP大鼠腸屏障的作用。但rITF 24 h組與ANP 24 h組腸黏膜評(píng)分無(wú)顯著差異，這可能與ITF半衰期較短有關(guān)，也可能因黏膜的恢復(fù)需要較長(zhǎng)的時(shí)間有關(guān)，需要做進(jìn)一步研究。

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2008-11-12)

(本文編輯：屠振興)

Effectofrecombinantintestinaltrefoilfactoronintestinalmucosaofacutenecrotizingpancreatitisinrats

SHI Lin-lin, MENG Li-na, YE Xian-de, ZHAO Cheng-man, BAO Hai-biao.

Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310006, China

MENGLi-na,Emailmln6713@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant intestinal trefoil factor (rITF) on the intestinal mucosa of acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats and explore the mechanism.Methods60 male SD rats were randomly divided into control group (n=20), ANP group (n=20), rITF group (n=20). ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (100 μl/100 g) into biliopancreatic duct. Rats in rITF group were injected with rITF (0.5 mg/100 g) before and after ANP induction. The rats in ANP group and control group

same amount of normal saline. Each group were sacrificed 12 h or 24 h later,respectively. Blood sample was taken to determine the serum level of amylase. Terminal ileum was resected to observe the pathologic changes; immunohistochemistry method was applied to detect the activity of NF-κB; the expression of TNF-α mRNA, ICAM-1 mRNA in intestinal mucosa was measured by RT-PCR.ResultsIntestinal injury score of ANP group was higher than that of control group (Plt;0.05), intestinal injury score of ANP 12 h group was higher than that of rITF 12 h group (Plt;0.05), but there was no significant difference between ANP 24 h group and rITF 24 h group. The number of positive NF-κB cells was 26±4, 55±8, 49±4,respectively; the relatively expression of TNF-α mRNA in terminal ileum was 0.050±0.005, 1.040±0.031 and 0.792±0.0256, respectively; the relatively expression of ICAM-1 mRNA was 0.045±0.010, 0.795±0.037 and 0.400±0.031, respectively, in control group, ANP group and rITF 12 h group. The corresponding values in the ANP group were significantly increased compared with those values in the control group (Plt;0.05 orPlt;0.01).ConclusionsrITF may protect the intestinal mucosa, the mechanism may include inhibit NF-κB activation, down-regulate TNF-α mRNA, ICAM-1 mRNA expression.

Pancreatitis, acute necrotizing; Intestinal mucosa; NF-kappa B; Intestinal trefoil factor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.012

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金項(xiàng)目計(jì)劃(2006A088)

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科

孟立娜，Email：mln6713@163.com