薄陸敏 李兆申 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶

·論著·

MUC2基因甲基化在胰腺癌細(xì)胞株、胰腺癌患者外周血中的檢測(cè)及意義

薄陸敏 李兆申 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶

目的檢測(cè)MUC2基因在胰腺癌細(xì)胞株、胰腺癌患者外周血中的甲基化情況，探討MUC2基因甲基化對(duì)胰腺癌早期診斷的價(jià)值。方法收集長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存的人胰腺癌細(xì)胞系SW1990、ASPC、PANC1、BxPC3、PaTu8988、CFPAC1及40例胰腺癌、15例慢性胰腺炎患者和25例正常對(duì)照者外周血標(biāo)本，應(yīng)用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)為基礎(chǔ)的PCR法檢測(cè)MUC2基因甲基化。結(jié)果人胰腺癌細(xì)胞系PANC1、BxPC3、PaTu8988未發(fā)生MUC2基因甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990胰腺癌細(xì)胞系發(fā)生MUC2基因甲基化。外周血標(biāo)本中，40例胰腺癌標(biāo)本甲基化率為40.0%(16例)，15例慢性胰腺炎無(wú)甲基化，25例正常對(duì)照甲基化率4.0%(1例)。胰腺癌與慢性胰腺炎、正常對(duì)照之間的甲基化率有顯著差異(Plt;0.01)。外周血標(biāo)本MUC2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化檢測(cè)診斷胰腺癌的敏感性為40%、特異性為97.5%、診斷準(zhǔn)確性68.8%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值94.1%、陰性預(yù)測(cè)值61.9%。結(jié)論用甲基化限制性酶切PCR法對(duì)外周血進(jìn)行MUC2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化檢測(cè)可望成為新的胰腺癌診斷的重要實(shí)驗(yàn)室輔助手段。

胰腺腫瘤； 甲基化； MUC2基因； 聚合酶鏈反應(yīng)

近年來(lái)DNA甲基化成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，它是人類(lèi)后成論學(xué)說(shuō)的主要復(fù)制后修飾方式[1-2]，通常發(fā)生在胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶5位碳原子上。MUC2屬于分泌型粘蛋白，在多種腫瘤，包括胰腺癌中異常表達(dá)，這與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化相關(guān)。有研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞中MUC2表達(dá)抑制與基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化相關(guān)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)分析胰腺癌細(xì)胞株、胰腺癌患者外周血中MUC2基因的甲基化情況，探討其對(duì)胰腺癌臨床診斷的價(jià)值。

材料與方法

一、胰腺癌細(xì)胞系

SW1990購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，ASPC、BxPC3、CFPAC1、PANC1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，PaTu8988由德國(guó)Marburg市Philipps大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所Elsasser博士惠贈(zèng)。常規(guī)培養(yǎng)傳代。收集細(xì)胞，采用酚/氯仿法抽提細(xì)胞DNA。

二、外周血標(biāo)本

取自2006年5月至2006年11月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院住院的胰腺癌患者40例，慢性胰腺炎(CP)患者15例。胰腺癌中29例由病理學(xué)診斷為導(dǎo)管腺癌，11例經(jīng)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)MRI及ERCP檢查等確診，其中男24例，女16例，年齡38～79歲，平均53.2歲。CP診斷參照慢性胰腺炎診治指南(2005年，南京)的標(biāo)準(zhǔn)，其中男10例，女5例，年齡36～68歲，平均48.6歲。25例正常對(duì)照來(lái)自長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(均排除其他腫瘤疾病)。所有病例均有較完整的臨床資料。

將1 ml EDTA抗凝血加入1 ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，3500 g離心15 min,傾去含裂解紅細(xì)胞上清，重復(fù)一次；用0.7 ml TE混懸沉淀物，37℃水浴溫育1 h；加入1 mg/ml蛋白酶K 0.2 ml,上下轉(zhuǎn)動(dòng)試管。待液體變黏稠后置50℃水浴保溫3 h，酚/氯仿法抽提DNA。

三、MUC2基因甲基化檢測(cè)

抽提的DNA采用DNA純化試劑盒(上海天根生物科技公司)純化，分別應(yīng)用HpaII、MSPI酶切。酶切反應(yīng)體系：模板DNA 0.5 μl/100 ng，10×T Buffer 3 μl，0.1% BSA 3 μl，HindⅢ 1 μl，MspI/HpaⅡ 2 μl/20U，ddH2O 20.5 μl。置37℃ 水浴 4 h，75℃ 20 min終止反應(yīng)，普通DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，洗脫液EB 20 μl洗脫DNA，-20℃保存。設(shè)未經(jīng)酶切的DNA作為對(duì)照，根據(jù)JENNY J等設(shè)計(jì)的引物序列，由上海生物工程公司合成。MUC2引物上游：5′-TGTGTTGGCATTCAGGCTAC-3′，下游：5′-GCAGGGGCGGTGTGGGTT-3′，擴(kuò)增片段259 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、61℃ 40 s、72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。

HpaⅡ?yàn)榧谆舾忻福荒茏R(shí)別甲基化的CmCGG序列；MspI為甲基化非敏感酶，可識(shí)別甲基化的CmCGG序列。PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)259 bp條帶時(shí)為MUC2基因啟動(dòng)子甲基化，反之則為非甲基化。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS軟件包處理數(shù)據(jù)，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)計(jì)算P值，Plt;0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞株MUC2基因甲基化狀態(tài)

所有胰腺癌細(xì)胞株未經(jīng)MspⅠ/HapⅡ限制性酶切前均可擴(kuò)增出259 bp大小的條帶。經(jīng)甲基化非敏感性酶MspⅠ酶切后，特異性PCR產(chǎn)物均消失。PANC1、BxPC3、PaTu8988經(jīng)甲基化敏感性酶HapⅡ酶切后，特異性PCR產(chǎn)物消失，表明MUC2基因未發(fā)生甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990經(jīng)HapⅡ酶切后仍可擴(kuò)增出259 bp大小的條帶，表明MUC2基因發(fā)生甲基化(圖1)。

二、胰腺癌患者外周血MUC2基因甲基化狀態(tài)

40例胰腺癌患者血標(biāo)本的MUC2基因甲基化率為40.0%(16/40)，15例CP患者血MUC2基因無(wú)甲基化，25例正常對(duì)照者的血MUC2基因甲基化率為4.0%(1/25)。胰腺癌與CP、正常對(duì)照組之間的MUC2基因甲基化率有顯著差異(Plt;0.01，圖2)。外周血標(biāo)本MUC2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化檢測(cè)診斷胰腺癌的敏感性為40%、特異性為97.5%、診斷準(zhǔn)確性68.8%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值94.1%、陰性預(yù)測(cè)值61.9%。以CA19-9gt;37 μ/ml診斷胰腺癌，則診斷的敏感性為65.0%、特異性為85%、診斷準(zhǔn)確性75%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值81.3%、陰性預(yù)測(cè)值70.8%。外周血標(biāo)本MUC2基因甲基化檢測(cè)與CA19-9相比，可提高診斷的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，而在診斷敏感性和準(zhǔn)確性方面無(wú)顯著差異。

討 論

由于胰腺癌在臨床上缺乏特異表現(xiàn)，影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)記物如CA19-9又很難在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，就診時(shí)3/4的患者已屬晚期，手術(shù)可切除率僅為4%～27%，5年生存率小于5%。因此，發(fā)展新的篩選手段、綜合分析高危人群和提高胰腺癌的早期診斷率，是改善預(yù)后的關(guān)鍵。

C：未酶切的擴(kuò)增條帶；M：經(jīng)MspⅠ酶切后的擴(kuò)增條帶；H：經(jīng)HapⅡ酶切后的擴(kuò)增條帶

圖16株胰腺癌細(xì)胞株MUC2基因甲基化的檢測(cè)結(jié)果

M： marker；C：未經(jīng)酶切的擴(kuò)增條帶；M：經(jīng)MspⅠ酶切后的擴(kuò)增條帶；H：經(jīng)HapⅡ酶切后的擴(kuò)增條帶

圖26例胰腺癌患者血MUC2基因甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物圖

生理狀態(tài)下，DNA甲基化在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素。目前腫瘤的基因甲基化研究主要集中在抑癌基因，這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化有關(guān)。由于CpG島發(fā)生甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)[6]。

DNA甲基化的檢測(cè)可分為基因組整體水平的甲基化檢測(cè)、特異位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)和新甲基化位點(diǎn)的尋找；檢測(cè)方法可分為基于PCR的甲基化分析方法、基于限制性?xún)?nèi)切酶的甲基化分析方法、基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。本課題采用以甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)為基礎(chǔ)的PCR法，是對(duì)特異性位點(diǎn)的DNA甲基化的檢測(cè)。這種方法利用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)甲基化區(qū)的不識(shí)別的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進(jìn)行分析。HpaⅡ和MspⅠ均能識(shí)別CCGG序列，然而當(dāng)序列中的胞嘧啶發(fā)生甲基化時(shí)，HpaⅡ不識(shí)別，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增分離產(chǎn)物，明確甲基化狀態(tài)[7]。這是一種經(jīng)典的甲基化研究方法，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確,實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋?zhuān)餐瑫r(shí)存在著酶不完全消化引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題。本課題采用非待測(cè)區(qū)的內(nèi)切酶HindⅢ和甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶HapⅡ同時(shí)消化DNA片段，隨后通過(guò)DNA片段純化，保留了含有甲基化區(qū)的片段，從而避免了MS-RE不完全消化引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題。

MUC2屬于分泌型粘蛋白，我們前期的研究顯示人胰腺癌細(xì)胞系MUC2表達(dá)抑制與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化相關(guān)。本課題通過(guò)檢測(cè)外周血標(biāo)本，顯示胰腺癌與CP、正常對(duì)照之間的MUC2基因甲基化存在顯著性差異(Plt;0.01)。外周血標(biāo)本MUC2基因甲基化檢測(cè)診斷胰腺癌與CA19-9相比，可提高診斷的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。因此，外周血MUC2基因甲基化檢測(cè)有可能成為胰腺癌臨床診斷的一種實(shí)驗(yàn)室輔助手段。

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2009-05-04)

(本文編輯：屠振興)

MethylationstatusofMUC2geneinpancreaticcarcinomacelllinesandperipheralbloodofpancreaticcarcinomapatients

BO Lu-min, LI Zhao-shen, GAO Jun, GONG Yan-fang, WU Hong-yu, JIN Jing.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

LIZhao-Shen,Emailzhsli@81890.net

ObjectiveTo analyze the methylation status of MUC2 gene in pancreatic carcinoma cell lines and peripheral blood of pancreatic carcinoma patients, and to explore the role of MUC2 methylation in the early diagnosis of pancreatic carcinoma.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines of SW1990, ASPC, PANC1, BxPC3, PaTu8988 and CFPAC1, and 40 peripheral blood samples of pancreatic carcinoma patients, 15 cases of chronic pancreatitis, 25 cases of normal controls were collected, and the methylation status of MUC2 gene was detected by methylation sensitive restriction endonuclease PCR.ResultsMUC2 methylation was not detected in PANC1, BxPC3, PaTu8988, but was detected in ASPC, CFPAC1, SW1990. Among the peripheral blood samples, the rate of methylation in pancreatic cancer was 40.0% (n=16), in chronic pancreatitis was 0%, in normal controls was 4.0% (n=1), and the difference among the three groups was statistically significant (Plt;0.01). The methylation of MUC2 gene CpG islands for the diagnosis of pancreatic carcinoma had a sensitivity of 40%, specificity of 97.5%, accuracy of 68.8%, positive predictive value of 94.1% and negative predictive value of 61.9%．ConclusionsThe detection of MUC2 hypermethylation in peripheral blood samples may be an potential marker for early diagnosis of pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Methylation; MUC2 genes; Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.014

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申：Email:zhsli@81890.net