266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院 侯建明

266003 中國(guó)海洋大學(xué) 藍(lán)進(jìn)

352200 福建古田藥業(yè)公司 郭樹(shù)興 林天錫

酶法逆向提取銀耳多糖的工藝研究

266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院 侯建明

266003 中國(guó)海洋大學(xué) 藍(lán)進(jìn)

352200 福建古田藥業(yè)公司 郭樹(shù)興 林天錫

目的研究一種提取銀耳多糖的工藝技術(shù)。方法根據(jù)銀耳子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組分，引導(dǎo)和設(shè)計(jì)逆向提取路線，從蛋白質(zhì)分子組成，篩選相應(yīng)的酶制劑，分解和清除非糖物質(zhì)，從而獲得提取物。結(jié)果工藝實(shí)施達(dá)到預(yù)期效果，銀耳多糖得率為（55±3）%。結(jié)論酶法逆向提取銀耳多糖工藝是可行的和可操作的。

銀耳多糖；逆向提取；工藝研究

酶法逆向提取工藝的要點(diǎn)是選擇酶制劑，分離銀耳蛋白質(zhì)，松解銀耳子實(shí)體細(xì)胞壁，進(jìn)一步清除脂質(zhì)使細(xì)胞質(zhì)膜和膜相結(jié)構(gòu)解體，去除非糖物質(zhì)，最后對(duì)主存于細(xì)胞壁的銀耳多糖進(jìn)行純化，獲取最終產(chǎn)物。本文將上述工藝的產(chǎn)生和依據(jù)、工藝流程的實(shí)施和提取結(jié)果報(bào)告如下。

1 逆向提取的研究

從銀耳直接提取多糖，分離困難，得率低，耗水量大。分析銀耳子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組分，可以設(shè)計(jì)出一條反向提取路線，采取逐個(gè)清除非糖物質(zhì)，最后獲取多糖。在銀耳子實(shí)體中最大部分是細(xì)胞壁，其厚度在150 nm以上。細(xì)胞壁可分四層，中間兩層是蛋白質(zhì)，里外兩層是多糖，而多糖占細(xì)胞組分80%以上[1,2]，如果分解和清除蛋白質(zhì)，整個(gè)細(xì)胞壁將被層分和松解，而呈多糖為主的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。次大部分是膜相結(jié)構(gòu)，這包括細(xì)胞質(zhì)膜和帶膜細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜等。膜的基本結(jié)構(gòu)為三層，里外兩層為蛋白質(zhì)，中間為雙脂層[2，3]，如果分解和清除蛋白質(zhì)加上清除雙脂層，整個(gè)膜相結(jié)構(gòu)將被解體。在細(xì)胞壁被松解，細(xì)胞膜被解體的情況下，細(xì)胞質(zhì)很容易被透析和清除。

2 酶的選擇

完成前述步驟須要解決的問(wèn)題是尋找能夠選擇性分解蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的物質(zhì)。本工藝選用專(zhuān)一性酶進(jìn)行酶解和清除。首先要分析銀耳蛋白質(zhì)氨基酸組成，從而選擇最適酶制劑，其次要求該酶的酶促作用條件要與提取溶液相適應(yīng)。這樣才能創(chuàng)造最佳提取環(huán)境。本研究采用福建古田銀耳，檢測(cè)其蛋白質(zhì)氨基酸組成和含量，再轉(zhuǎn)換成分子數(shù)（表1）。

表1 銀耳蛋白質(zhì)氨基酸組成、含量和分子比

參照不同氨基酸的分子比，篩選相應(yīng)的蛋白酶，先引起關(guān)注的是胃蛋白酶，其專(zhuān)一性是切斷苯丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸殘基羧基側(cè)的肽鍵[4]，而這三種氨基酸分子數(shù)分別為3.44、7.55和10.39，總分子數(shù)為21.38%，這表示每100個(gè)氨基酸殘基中適予胃蛋白酶切斷的肽鍵有21個(gè)，這個(gè)數(shù)量足以將銀耳蛋白質(zhì)全部解體。但是，由于胃蛋白酶要求pH過(guò)低（1.8～2.0），不利于銀耳的吸水和膨脹，因而不作首選。代之被選中的是胰酶，它是混合酶，本工藝只用其胰蛋白酶、凝乳酶和胰脂酶，雖然胰蛋白酶的專(zhuān)一性只切斷精氨酸和賴(lài)氨酸殘基羧基側(cè)肽鍵，其分子數(shù)分別為7.62和5.86，兩個(gè)總和只有13.48%。但加上凝乳酶，它的專(zhuān)一性類(lèi)于胃蛋白酶[4]，這樣兩酶相加，使每100個(gè)氨基酸殘基中有5種氨基酸相連的35個(gè)羧基側(cè)肽鍵可被兩酶切斷，同時(shí)混合酶中還有胰脂酶，可以酶解和清除脂類(lèi)。胰酶的最適pH為8～9，它和銀耳適于堿液中吸水膨脹的特性相適應(yīng)，因此胰酶作為首選酶制劑。

3 工藝試驗(yàn)與結(jié)果

本工藝可分三大部分，原料予處，酶解和透析。關(guān)鍵技術(shù)是酶解。予處必須滿足酶解要求，酶解要在水中進(jìn)行，因此予處要使原料充分水化。本工藝不細(xì)碎銀耳，用較大的銀耳朵片（4～6 cm），通過(guò)堿化溶液，調(diào)節(jié)pH，使朵片極度吸水，膨脹至銀耳原重量的15～18倍以上，之后移入酶解溶液中，按胰酶酶促作用最適條件要求，pH 7.5～8.5，溫度35℃～38℃保溫酶解1～2 h，從酶解液中移出酶解后的銀耳，置于pH為9～10的堿性溶液中浸泡。10～20 min后開(kāi)始加溫至90℃，持續(xù)0.5～1 h，攪動(dòng)，此時(shí)有泡沫殘?jiān)〕鏊?，鏡檢可見(jiàn)珍珠樣脂肪球和細(xì)胞內(nèi)容殘片，除去殘?jiān)?。然后從堿液中將絮狀固形物移出，置于經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)至pH 6.0～6.5的酸性溶液中，浸泡20～40 min，原銀耳中的小分子非提取物和酸溶性無(wú)機(jī)物將被除去。此時(shí)絮狀固形物呈現(xiàn)晶瑩剔透、白色婚紗模樣。最后，將絮狀固形物經(jīng)過(guò)弱堿液、清水浸泡透析，濾出、瀝干、脫水、低溫干燥得銀耳多糖干品。

本工藝提取的是銀耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多糖，得率為（55±3）%，經(jīng)硫酸蒽酮法定量，總糖含量達(dá)（95± 2）%，紅外光譜檢測(cè)（圖1）。

圖1 銀耳多糖的紅外光譜

4 討論

酶法逆向提取銀耳多糖獲得預(yù)期效果，證明其工藝的可行性和可操作性。本工藝基礎(chǔ)建立在細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)上，在銀耳干品中，細(xì)胞壁幾乎占據(jù)整個(gè)子實(shí)體，而多糖又占細(xì)胞壁成分的80%以上，去小存大，符合提取邏輯，這是逆向提取的理論根據(jù)。其次從蛋白質(zhì)氨基酸組成和不同氨基酸分子數(shù)，篩選酶類(lèi)，酶解和清除蛋白質(zhì)，脂酶清除脂類(lèi)，從而保證了逆向提取工藝的順利實(shí)施。本工藝采用生物酶提取有利于環(huán)境保護(hù)和資源綜合利用，減少排廢。提取的多糖用于增強(qiáng)免疫力[5]、降脂[6]、抗?jié)僛7]和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[8]等的試驗(yàn)中顯示顯著陽(yáng)性效應(yīng)。

1 周與良，邢來(lái)君，真菌學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1986.27-31

2 楊慶堯.食用菌生物學(xué)基礎(chǔ)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1981

3 deacon J.W.Introduction to modern mycology[M].Oxford Blackwell Scientific Publication,1980.26-30

4 黃文濤，胡學(xué)智，譯.酶應(yīng)用手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989

5 侯建明，王愛(ài)東，雷清新，等.銀耳多糖對(duì)免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)報(bào)告[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2007，16(11)：641

6 侯建明，陳剛，藍(lán)進(jìn).銀耳多糖對(duì)脂類(lèi)代謝影響的實(shí)驗(yàn)報(bào)告[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2008，17(4)：234

7 侯建明，翁維權(quán).銀耳多糖治療十二脂腸潰瘍124例療效觀察[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2008，17(10)：613

8 侯建明，藍(lán)進(jìn)，高益槐.銀耳多糖局部應(yīng)用對(duì)大鼠創(chuàng)傷愈合的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2007，24(8)：965

Ob jective To study the main technique of extracting tremella polysaccharides.Methods From analyzing the m icrostructure of fruiting body and cell constituent of Tremella,to induce and design a process of reversal extraction;through the analysis of the molecular constituent of protein,to select the adaptable enzyme,then to decompose and remove the non-saccharide substances,So that the extract would be gotten.Results The process of extraction was carried out successfully and achieved the expectative outcome.Conclusion The process of the enzymatic reversal extraction of Tremella polysaccharides was feasible and operable.

Tremella;Polysaccharide;Reversal extraction

1005-619X（2009）04-0292-02

2008-08-09）