車吉忠 李晨光 張大田

[摘要] 引起腎缺血再灌注損傷的因素主要有氧自由基生成增多、鈣超載、能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡及粒細(xì)胞浸潤等,本文就氧自由基、鈣超載在腎缺血再灌注損傷中的作用和兩者關(guān)系作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 腎;缺血再灌注損傷;氧自由基;鈣超載

[中圖分類號] R334+.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1004-8650(2009)05-127-03

腎臟的缺血再灌注在臨床上較常見,如腎移植、腎損傷、休克、腎實質(zhì)切開取石、腎部分切除、腎血管性高血壓的手術(shù)治療、胸腹主動脈瘤手術(shù)、體外腎臟等。腎臟是一個高灌流的器官,在缺血及再灌注的過程中不可避免會受到傷害,這種損害被稱為缺血再灌注損傷(IRI)。他是Jennings等于1960年首先提出的,是指組織器官缺血后再灌注,不僅不能使組織器官功能恢復(fù),反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。IRI在許多重要器官均可發(fā)生,是臨床上最常見的病理生理變化。引起IRI的相關(guān)因素很多,下面就氧自由基、鈣(Ca2+)超載在腎缺血再灌注損傷中的作用和兩者關(guān)系作一綜述,以供臨床和實驗中腎保護(hù)研究作一參考。

1氧自由基(OFR)與腎缺血再灌注損傷

由氧誘發(fā)的自由基稱為氧自由基,其主要包括:羥基自由基(OH-)和超氧陰離子自由基(O2·-)。正常生理狀態(tài)下,體內(nèi)能產(chǎn)生少量氧自由基,約占機(jī)體總氧耗量的5%。由于機(jī)體內(nèi)具有滅活氧自由基的酶系統(tǒng)使正常情況下產(chǎn)生的氧自由基迅速消除,不產(chǎn)生損傷作用。當(dāng)組織細(xì)胞缺血、缺氧時,氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失,而生成系統(tǒng)卻活性增強(qiáng),一旦恢復(fù)血流供應(yīng)和氧供,氧自由基便大量產(chǎn)生與急劇“堆積”,以不同方式造成細(xì)胞急性或慢性損傷[1]。

1.1氧自由基的生成

氧自由基的來源主要有兩個方面, 一是電離輻射、某些藥物、酒精、吸煙或高壓氧中毒等,這些稱外源性自由基;二是機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生自由基,即內(nèi)源性自由基。在腎臟缺血再灌注過程中,氧自由基主要來源于內(nèi)源性自由基,其生成主要有3個途徑: (1)黃嘌呤氧化酶途徑。(2)線粒體呼吸鏈途徑。缺血后的血管內(nèi)皮細(xì)胞是氧自由基的主要來源,而在內(nèi)皮細(xì)胞中,線粒體又是氧自由基產(chǎn)生的主要部位。研究證實,活性氧是線粒體在生理和病理條件下產(chǎn)生的[2]。(3)白細(xì)胞途徑。腎臟缺血再灌注時大量聚集在缺血區(qū)的白細(xì)胞被激活,氧耗量迅速增加,這時的O2經(jīng)白細(xì)胞的還原型輔酶II的作用,產(chǎn)生超氧陰離子,后者經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的過氧化氫、羥自由基等。

1.2氧自由基引起腎缺血再灌注損傷的機(jī)制

正常的線粒體有內(nèi)膜和外膜兩層膜結(jié)構(gòu),兩層膜中間為膜間腔,內(nèi)膜內(nèi)側(cè)為基質(zhì)。線粒體外膜通透性較高,內(nèi)膜對各種物質(zhì)的通過性有嚴(yán)格的選擇性,幾乎所有的離子和不帶電荷的小分子化合物都不能自由的通過。由于線粒體內(nèi)膜對離子通透性的嚴(yán)格限制,結(jié)果使基質(zhì)內(nèi)充滿了高選擇性的分子。電化學(xué)梯度的存在是維持線粒體產(chǎn)生ATP的基礎(chǔ),氧化劑和抗氧化劑形成的穩(wěn)定平衡是一些生物過程所必須的,如維持Ca2+循環(huán)、酶的活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[3]。生理條件下,每分子O2在復(fù)合體Ⅳ的水平被4個電子還原(四價還原),但仍然有約2%-4%的氧只能得到單個的從電子傳遞鏈上復(fù)合體漏出的電子(單價還原),形成活性氧(ROS)。這種少量產(chǎn)生ROS是保持氧化還原狀態(tài)所必須的,對基因的活性,Ca2+循環(huán)以及維持許多酶的功能非常重要。缺血期腎臟的血流阻斷使細(xì)胞供氧明顯減少,從而導(dǎo)致細(xì)胞低氧和氧化磷酸化抑制,細(xì)胞內(nèi)ATP濃度快速下降。為了保持線粒體完整性,線粒體內(nèi)的ATP合酶水解ATP以保持線粒體跨膜電位[4]。ATP水解導(dǎo)致游離的磷酸鹽升高,促使內(nèi)膜通透性增加,缺血時間延長導(dǎo)致位于復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅱ中的鐵硫蛋白的退化,引起二價鐵離子的釋放,在再灌注期參與ROS的形成[5]。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅱ是產(chǎn)生ROS的主要因素,氧化呼吸鏈的阻斷可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。

氧自由基能使腎組織細(xì)胞生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,生成脂質(zhì)過氧化物(LPO),LPO分解時產(chǎn)生的丙二醛能使DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。當(dāng)DNA的雙股螺旋同時被交聯(lián),細(xì)胞分裂時雙股螺旋無法解開,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,蛋白質(zhì)被交聯(lián)后形成無定形的沉淀物。由于蛋白質(zhì)被破壞,一些酶活性降低,影響細(xì)胞代謝。細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化可引起膜通透性增強(qiáng),線粒體膨脹,溶酶體酶的釋放,酶的失活等損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能改變,出現(xiàn)細(xì)胞的變性和壞死。Castedo等[6]在動物實驗中發(fā)現(xiàn),再灌注后細(xì)胞內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng),形成多種生物活性物質(zhì),如血栓素、前列腺素等,促進(jìn)再灌注損傷。此外,氧自由基還可作用于細(xì)胞膜上的寡糖鏈中糖分子的羥基碳,使之氧化成為不飽和碳基或二聚體,引起細(xì)胞的多糖鏈破壞,造成細(xì)胞自溶。

近年的研究揭示, 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化參與了缺血/再灌注性腎損傷[7]。NF-κB是氧化還原作用敏感的轉(zhuǎn)錄因子,它調(diào)控著多種細(xì)胞因子、生長因子和化學(xué)趨化因子的表達(dá)[8] 如,TNF- 、TNF-β、白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-11、IL-12、IL-17),細(xì)胞趨化因子(IL-8、MIP-1、MCP-1、RANTES),一氧化氮合成酶(iNOS)及粘附分子(ICAM-1,VCAM-1,E-seletin,P-seletin)。靜息狀態(tài)下NF-κB多以P50和P65二聚體與其抑制蛋白IκB相結(jié)合而存在于胞漿中,呈無活性狀態(tài)。當(dāng)受到外源性刺激如脂多糖、缺血再灌注、TNF-α等激活時,IκB迅速磷酸化而與NF-κB解離?；罨腘F-κB從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核,在核內(nèi)與多種基因啟動子特異性序列結(jié)合,并啟動轉(zhuǎn)錄發(fā)揮其調(diào)控作用[8]。NF-κB是調(diào)控諸多基因的轉(zhuǎn)錄因子,參與多種基因特別是與炎癥及免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控,其中包括炎性細(xì)胞因子等。孫艷玲等研究發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注后NF-κB大量活化,活化的NF-κB通過調(diào)控細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)而參與了腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展[9]。氧自由基可激活NF-κB,促進(jìn)炎性介質(zhì)的表達(dá),進(jìn)而引起細(xì)胞損害。

此外,氧自由基的大量產(chǎn)生和堆積可以誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞的凋亡,其途徑主要為:①直接損傷線粒體,釋放細(xì)胞色素C,激活同型半胱氨酸蛋白酶,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。②破壞抑癌基因P53和HIF-1α,引起細(xì)胞凋亡[11]。③攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,以及由此產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物,消弱細(xì)胞的生存能力,從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12]。④激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶C,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13,14]。

2Ca2+超載與腎缺血再灌注損傷

1972年Shen和Jennings發(fā)現(xiàn)犬心臟冠狀動脈短暫閉塞后復(fù)灌可加速細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積聚,并首次提出鈣超載之說。維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+梯度相對穩(wěn)定的機(jī)制是:受體依賴性鈣通道、電壓依賴性鈣通道(VDAC通道)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體、肌漿網(wǎng)對鈣的調(diào)節(jié)、Ca2+泵、Na+-Ca2+交換體、鈣調(diào)蛋白等。破壞以上任何一個機(jī)制均會引起細(xì)胞內(nèi)外鈣的重新分布,進(jìn)而造成一系列的損傷。

鈣超載引起腎細(xì)胞受損,其機(jī)制主要有以下幾個方面:① 線粒體功能障礙。線粒體通過多種鈣轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,從內(nèi)膜攝取和釋放鈣,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)局部和整個細(xì)胞的鈣離子濃度。在細(xì)胞內(nèi)鈣超載時,線粒體的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)器(MCU)攝取細(xì)胞內(nèi)鈣。當(dāng)線粒體對鈣的攝取量達(dá)到一定程度時,引起線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)的開放。PTP是近年來發(fā)現(xiàn)的,他是一種位于線粒體膜上的復(fù)合物,結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn),他含有CyP-D,也可能包括肌酸酐激酶,線粒體外膜蛋白或VDAC通道以及己糖激酶。PTP開放時許多大分子非選擇性地由胞漿向線粒體擴(kuò)散,導(dǎo)致線粒體膜電位的破壞和功能障礙,細(xì)胞內(nèi)鈣超載時,Ca2+也可與PTP相結(jié)合,導(dǎo)致線粒體腫脹,功能失調(diào),均能引起細(xì)胞死亡[15]。② 酶的激活。細(xì)胞內(nèi)鈣超載時,Ca2+ 激活Ca2+依賴的磷脂酶A2和鈣敏感性蛋白酶C,磷脂酶A2和蛋白激酶C的活化可導(dǎo)致花生四烯酸形成,花生四烯酸不僅通過其清潔劑樣性能干擾細(xì)胞膜,他還是環(huán)氧化酶的重要底物?；ㄉ南┧岬幕罨蓪?dǎo)致前列腺素和血栓素A的形成,而前列腺素是OFR產(chǎn)生的底物。磷脂酶C催化磷酸肌醇水解能產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG),前者可動員細(xì)胞內(nèi)Ca2+,后者能激活蛋白激酶C,間接地通過Ca2+通道和Na+-H+交換加劇Ca2+超載[16]。激活的鈣蛋白酶能促使作為細(xì)胞骨架成分的胞襯蛋白裂解,在Ca2+的刺激下,核支架蛋白酶使分離核中的纖層蛋白降解,從而直接損傷細(xì)胞[17]。鈣蛋白酶是各種細(xì)胞毒物質(zhì)造成細(xì)胞死亡的重要中介,用線粒體抑制劑抗霉素A作用于近端腎小管細(xì)胞時,鈣蛋白酶活性增加并引起外鈣內(nèi)流,接著鈣蛋白酶從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上,從而引起Cl-內(nèi)流和細(xì)胞溶解死亡。鈣蛋白酶的激活在細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮雙重作用。起始的鈣蛋白酶激活導(dǎo)致胞外Ca2+經(jīng)硝苯地平敏感的鈣通道內(nèi)流,接著轉(zhuǎn)移到胞膜上,引起Cl-內(nèi)流和細(xì)胞死亡[18]。③Na+-K+ ATP酶活性受到抑制。缺血期腎臟血流減少甚至完全阻斷使細(xì)胞供氧明顯減少,從而導(dǎo)致細(xì)胞低氧和氧化磷酸化抑制,細(xì)胞內(nèi)ATP濃度快速下降和ADP短暫的升高,大量的磷酸鏈堆積,細(xì)胞通過促進(jìn)糖酵解以維持細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。因糖酵解產(chǎn)生乳酸使細(xì)胞pH下降。缺血持續(xù)時ATP濃度的下降使Na+-K+ ATP酶活性受到抑制,胞漿Na+濃度進(jìn)行性增加,伴細(xì)胞外K+濃度增加。胞內(nèi)Na+激活Na+-Ca2+交換和Na+-H+交換使胞內(nèi)Ca2+和H+濃度的升高。細(xì)胞內(nèi)Na+升高也導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化引起短暫的電壓依賴型Ca2+通道開放,Ca2+內(nèi)流增加。此外,有人提出,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增多可能是細(xì)胞粘附蛋白介導(dǎo)中性粒細(xì)胞(PMN)釋放的磷脂酶及氧自由基對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及肌漿網(wǎng)Ca2+泵功能破壞的結(jié)果,因而認(rèn)為Ca2+負(fù)荷過重是氧自由基及PMN作用機(jī)制的一部分[19]。

3氧自由基與Ca2+超載關(guān)系

再灌注時,鈣離子交換受阻,導(dǎo)致線粒體及溶酶體內(nèi)Ca2+濃度升高,Ca2+與胞漿受體鈣調(diào)蛋白結(jié)合后,激活蛋白酶和磷酯酶A,引起膜磷脂水解(其過程伴隨有OFR的產(chǎn)生),游離脂肪酸釋放,使細(xì)胞膜和線粒體膜的結(jié)構(gòu)和骨架破壞,線粒體腫脹導(dǎo)致氧化-磷酸化脫偶聯(lián),使能量代謝發(fā)生障礙。蛋白酶的激活,使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶(XO),而XO無法氧化次黃嘌呤,導(dǎo)致其大量堆積。在再灌注狀態(tài)下,大量分子氧在XO催化下促進(jìn)堆積的次黃嘌呤分解,伴隨形成大量的OFR,而腎臟內(nèi)的SOD、CAT等氧自由基清除劑因為缺血缺氧抑制了其活性,不能有效地清除OFR,以致OFR的大量堆積。過量的Ca2+還可以激活中性粒細(xì)胞,引起其“代謝爆發(fā)”,產(chǎn)生大量OFR。鈣超載與氧自由基的產(chǎn)生是腎缺血再灌注損傷的重要因素,二者相互影響,協(xié)同作用,導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷加重。OFR使脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),改變膜通透性,促進(jìn)新的Ca2+內(nèi)流,同時OFR破壞線粒體結(jié)構(gòu),干擾氧化磷酸化過程,加速ATP等高能磷酸化合物的耗竭,使ATP依賴的離子泵活性下降,其結(jié)果也促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加[20]。

綜上所述,氧自由基、Ca2+超載引起腎缺血再灌注損傷的機(jī)制是極其復(fù)雜的,兩者相互聯(lián)系,協(xié)同作用,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致腎細(xì)胞不可逆損傷。此外,腎缺血再灌注損傷本身是一個由多個因素、多個途徑、多個方面所介導(dǎo)的復(fù)雜過程,目前具體機(jī)制尚未清楚,相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)對缺血再灌注損傷的深入研究,人們會逐漸了解腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制,為臨床治療指明方向。

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(收稿日期2009-02-05)