張穎　馬林　李健　等

[摘要] 目的 研究過(guò)量氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成釉細(xì)胞內(nèi)鈣超載及細(xì)胞凋亡的影響。方法 取大鼠成釉細(xì)胞系HAT-7細(xì)胞，分別加入不同濃度（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol·L-1）的氟化鈉培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，采用Cell Counting Kit 8（CCK-8）試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的活性，流式細(xì)胞術(shù)分析氟對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，激光掃描共聚焦顯微鏡、Western blot試驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)過(guò)量氟誘導(dǎo)大鼠成釉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 氟化鈉濃度高于1.6 mmol·L-1時(shí)，可抑制成釉細(xì)胞的活性，成釉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞早期凋亡數(shù)量增加，并且隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡的數(shù)量也隨之增加。結(jié)論 過(guò)量氟可引起成釉細(xì)胞內(nèi)鈣超載，誘導(dǎo)成釉細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 氟； 成釉細(xì)胞； 鈣超載； 鈣網(wǎng)蛋白； 細(xì)胞凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.003

氟是一種具有防齲功能的微量元素，但在牙齒的發(fā)育礦化時(shí)期，若機(jī)體攝入過(guò)量的氟會(huì)引起一種特殊的釉質(zhì)發(fā)育不全，稱(chēng)為氟牙癥。氟牙癥的發(fā)病機(jī)制還未完全明確。有學(xué)者認(rèn)為，地方性慢性氟中毒性疾病屬于“鈣矛盾”疾病[1]，即整個(gè)機(jī)體缺鈣，但細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多。Ca2+參與和調(diào)控多種細(xì)胞和組織的生理活動(dòng)，包括肌肉收縮、新陳代謝以及細(xì)胞分裂等[2-3]。但是，若細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過(guò)高，可引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生[4-5]。成釉細(xì)胞是釉質(zhì)形成的關(guān)鍵，過(guò)量氟攝入機(jī)體，是否會(huì)導(dǎo)致成釉細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加，產(chǎn)生鈣超載，誘導(dǎo)成釉細(xì)胞凋亡，目前還少有研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的氟化鈉作用于體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞系HAT-7細(xì)胞，觀察氟化鈉對(duì)成釉細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，為進(jìn)一步研究氟牙癥的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

3 討論

釉質(zhì)的發(fā)育過(guò)程是復(fù)雜并受到精確調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過(guò)程[6]。成釉細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控釉質(zhì)有機(jī)基質(zhì)的合成、分泌和移除，同時(shí)也與鈣鹽的活躍轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，高濃度的氟化鈉（1.6、3.2、6.4 mmol·L-1）培養(yǎng)HAT-7細(xì)胞48 h，成釉細(xì)胞開(kāi)始凋亡，顯著降低了細(xì)胞的活性。有研究[7]表明，氟化鈉（100 ng·mL-1）可促進(jìn)細(xì)胞膜Ca2+通道在短時(shí)間內(nèi)（20 s）迅速開(kāi)放，使人成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度氟化鈉作用48 h后，HAT-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加，并且Ca2+濃度增加與氟化鈉濃度呈正相關(guān)。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的主要信使之一，在維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用[8]。當(dāng)一些有害因素引起鈣平衡系統(tǒng)功能失調(diào)時(shí)，Ca2+分布紊亂，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常性升高，即為鈣超載，此時(shí)可引起細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究結(jié)果提示，過(guò)量的氟可以引起HAT-7細(xì)胞發(fā)生鈣超載，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

CRT是一種類(lèi)凝集素蛋白，也是主要的Ca2+結(jié)合蛋白，可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身Ca2+結(jié)合能力和肌漿網(wǎng)Ca2+泵的活性而調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)[11]。目前對(duì)CRT在細(xì)胞凋亡中的作用尚存在爭(zhēng)議。有學(xué)者[12]認(rèn)為，過(guò)度表達(dá)的CRT引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+反應(yīng)性增強(qiáng)，誘導(dǎo)Ca2+依賴(lài)性蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2A，PP2A）的表達(dá)和活性均上調(diào)，使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）去磷酸化，抑制PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性增加。有學(xué)者[13-14]應(yīng)用大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，證明CRT過(guò)表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放及細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，從而加重細(xì)胞質(zhì)Ca2+超載，增加細(xì)胞對(duì)應(yīng)激致凋亡的敏感性。與上述研究結(jié)論相反，Hung等[15]發(fā)現(xiàn)CRT過(guò)表達(dá)可以減輕H2O2對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，0.8 mmol·L-1氟化鈉培養(yǎng)HAT-7細(xì)胞48 h后，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，CRT mRNA表達(dá)量升高；當(dāng)氟化鈉濃度為1.2 mmol·L-1時(shí)，CRT mRNA表達(dá)量最高；氟化鈉濃度為1.6 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。通過(guò)CRT的作用機(jī)制，筆者猜想，當(dāng)CRT少量過(guò)表達(dá)時(shí)，可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的緩沖能力和/或抑制過(guò)多Ca2+對(duì)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用；但當(dāng)CRT過(guò)表達(dá)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)多時(shí)，其保護(hù)細(xì)胞的作用將消失，轉(zhuǎn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。同時(shí)本研究通過(guò)Western blot試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氟化鈉濃度為1.2、1.6 mmol·L-1時(shí)，CRT表達(dá)量增高，但氟化鈉濃度為0.8 mmol·L-1時(shí)，CRT表達(dá)量與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，分析原因可能是由于在mRNA轉(zhuǎn)錄、修飾蛋白質(zhì)的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)也發(fā)生其他蛋白質(zhì)的調(diào)控，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的量與mRNA固有的量不相匹配。

綜上所述，氟對(duì)成釉細(xì)胞的影響與氟濃度有關(guān)，過(guò)量的氟可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Ca2+超載介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在Ca2+超載早期，CRT起到保護(hù)細(xì)胞的作用；當(dāng)Ca2+超載過(guò)于嚴(yán)重或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，CRT則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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（本文采編 王晴）