劉天強　肖　丹　何　健　董自亮

摘 要:目的:構(gòu)建滴眼液刺激性體外評價方法,篩查SS熊膽眼藥水刺激性原因并采取適宜方法解決。方法:采用兔角膜上皮細(xì)胞毒性試驗(SIRC-MTT)對4種熊膽滴眼液進行評價,將結(jié)果與臨床刺激性評分進行相關(guān)性分析,運用SIRC-MTT篩查SS熊膽眼藥水的刺激性原因并進行解決。結(jié)果:相關(guān)系數(shù)為0.961,說明SIRC-MTT能較好評價熊膽滴眼液眼刺激性;造成熊膽眼藥水刺激性較強的原因為羥苯乙酯與熊膽原液的共存;采用減少羥苯乙酯用量(調(diào)整至0.04%)、添加羧甲基纖維素鈉(0.2%~0.25%)均能增加角膜上皮細(xì)胞存活率。結(jié)論:SIRC-MTT是SS有效的體外刺激性評價方法;降低羥苯乙酯用量和添加羧甲基纖維素鈉均能降低熊膽眼藥水的刺激性。

關(guān)鍵詞:刺激性;熊膽眼藥水;細(xì)胞毒性試驗;角膜上皮細(xì)胞

中圖分類號:R988.1文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0022-04

SS熊膽眼藥水由熊膽單味中藥研制而成,具有清熱解毒,祛翳明目的功效,主要用于治療急、慢性卡他性結(jié)膜炎,但大多患者在使用中發(fā)現(xiàn)該藥具有較強刺激性,嚴(yán)重影響了其臨床用藥?，F(xiàn)今評價眼刺激性的方法為兔眼刺激法(draize test),該法具有主觀性強,實驗差異大等缺點[1],難以尋找出SS熊膽眼藥水刺激性較強的內(nèi)在原因。該研究擬建立SS新的體外刺激性評價方法,用于篩查該眼藥水的刺激性原因,并解決該問題。

1 材料與方法

1.1 受試物、儀器與試劑

SS熊膽眼藥水(成都某藥業(yè)公司提供),熊膽粉滴眼液(某藥業(yè)公司),熊膽黃芩滴眼液(黑龍江黑寶藥業(yè)),復(fù)方熊膽滴眼液(長春普華藥業(yè)),熊膽、羥苯乙酯、羧甲基纖維素鈉(成都某藥業(yè)公司提供),氯化鈉、硼酸、硼砂(科龍試劑有限公司),透明質(zhì)酸鈉(Solarbio);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo),超凈工作臺(蘇州凈化),倒置顯微鏡(奧林巴斯),自動酶標(biāo)儀(BIO-RAD),DMEM低糖(GIBCO,USA),胎牛血清(甘肅民海),MTT(SIGMA,USA),F12(GIBCO,USA),青霉素(石家莊制藥有限公司),鏈霉素(華北制藥股份有限公司),L-谷氨酰胺 DMSO(SIGMA,USA)。培養(yǎng)基組成(20%胎牛血清, F12培養(yǎng)基∶DMEM低糖=3∶1,2mM/100mL谷氨酰胺,100U/mL雙抗溶液)。

1.2 動物

健康白種家兔,雌雄不限,體重2500±200g,成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.3 兔角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)[2,3]

健康白種家兔,斷頭放血處死后,無菌條件下摘取眼球,104U?L-1青鏈霉素溶液漂洗2次,,取角膜緣部上皮組織:沿角鞏膜緣灰白交界后1mm處穿刺,取下包括1mm鞏膜緣的眼前段組織,解剖鏡下去除晶狀體、虹膜等附屬組織,將得到的角膜組織逐個撕取角膜內(nèi)皮及后彈力層,然后沿透明角膜內(nèi)1mm,環(huán)狀取下2～2.5mm寬的角膜緣組織,剪成1mm×1mm×1mm大小;將組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3d首次換液,以后隔日換液。原代培養(yǎng)至80%融合后,0.25%胰酶消化傳代, 3d后首次換液,以后隔日換液,直至細(xì)胞融合。傳代細(xì)胞(2-4代)用于實驗研究。將實驗用細(xì)胞以104個/孔細(xì)胞接種于96培養(yǎng)板中,培養(yǎng)(37℃、5%CO₂)5d,細(xì)胞達(dá)到鋪平狀態(tài)。

1.4 評價方法的建立

1.4.1 市售滴眼液刺激性評價

對市售4種熊膽滴眼液臨床用藥狀況進行分析,其刺激性評價結(jié)果見表1。

1.4.2 體外刺激性評價方法

(1)直接接觸法[4]。 將培養(yǎng)液吸出,加入不同滴眼液溶液100μL作用20min,吸出滴眼液,PBS沖洗兩次,加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基180μL,20μLMTT(5mg/mL),37℃孵育4h,吸出培養(yǎng)基,加入150μLDMSO,570nm酶標(biāo)儀測定吸光度。

(2)混合培養(yǎng)法[5]。將培養(yǎng)液吸出,加入含40μL的滴眼液樣品的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后吸出含樣品溶液的培養(yǎng)基,其它同直接接觸法。

對照組采用PBS溶液,細(xì)胞存活率作為評價指標(biāo)。細(xì)胞存活率(cell survival rates)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%=(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%。各濃度樣品設(shè)6個復(fù)孔進行試驗。

將由直接接觸法與混合培養(yǎng)法評價滴眼液對兔角膜上皮細(xì)胞毒性的實驗結(jié)果與臨床刺激性評分進行相關(guān)性研究,選擇相關(guān)性較好的方法作為本研究評價細(xì)胞毒性的方法。

1.5 刺激源篩查

熊膽眼藥水刺激性源可能來自處方中不同物質(zhì)之間的相互作用,也可能來自制備工藝各環(huán)節(jié)。本研究從這兩個方面進行刺激源的篩查。

1.5.1處方考察

處方:熊膽粉5.0g、硼酸12.0g、硼砂0.6g、氯化鈉2.2g、羥苯乙酯0.8g 按照處方,根據(jù)表2配制相應(yīng)熊膽眼藥水樣品,采用優(yōu)選的細(xì)胞毒性評價方法進行刺激性評價(樣品S-1—S-7)。

1.5.2 制備工藝考察

制法:熊膽粉加注射用水100mL,加熱煮沸10min,使溶解,放冷,加乙醇至含醇量為75%,靜置24h,濾過,濾液回收乙醇后,備用。另取硼酸、硼砂、氯化鈉、羥苯乙酯加水800mL,加熱煮沸至完全溶解,濾過,濾液加入上述藥液中,煮沸30min,放冷,加注射用水至1000mL,用微孔濾膜(0.22μm)濾過,分裝,即得。

按照該滴眼液制備工藝,對提取時間、精制工藝、合并煎煮時間3個環(huán)節(jié)進行考察,根據(jù)相關(guān)工藝變更工藝水平配制各樣品溶液。

1.6 刺激性解決方法研究

對1.5環(huán)節(jié)中篩查出的刺激性原因進行分析,并采用以下4種方法進行針對性的解決。

1.6.1 更換防腐劑

將處方中羥苯乙酯分別更換為1.5g、1.8g、2.1g山梨酸,然后按照處方要求配制樣品,標(biāo)記為S-8、S-9、S-10。

1.6.2 降低羥苯乙酯用量

將處方中羥苯乙酯用量調(diào)整為0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g,配制成不同樣品。

1.6.3 添加增粘劑羧甲基纖維素鈉

按照不同比例(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)配制添加羧甲基纖維素鈉樣品。

1.6.4 添加增粘劑透明質(zhì)酸鈉

按照不同比例(0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%)配制添加透明質(zhì)酸鈉的樣品。

2 試驗結(jié)果

2.1 方法學(xué)的確立

通過相關(guān)性分析,結(jié)果如圖1、圖2,混合培養(yǎng)法(R=0.961,F=545.409,P=0.000)評價滴眼液刺激性優(yōu)于直接接觸法(R=0.619,F=13.657,P=0.001),故采用混合培養(yǎng)法作為細(xì)胞毒性研究方法用于該實驗研究。

2.2 刺激源分析結(jié)果

2.2.1 處方刺激源篩查結(jié)果

由圖3可知,當(dāng)樣品中同時含有熊膽原液與羥苯乙酯,細(xì)胞毒性明顯增加,角膜上皮細(xì)胞存活率低于70%(S-2、S-3、S-4、S-5),而當(dāng)樣品中無熊膽原液(S-6),或者無羥苯乙酯(S-1,S-7),角膜上皮細(xì)胞的存活率與陰性對照組(S-31)之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義,提示熊膽原液與羥苯乙酯共存增加了眼藥水的刺激性。

2.2.2 制備工藝篩查結(jié)果

(1)對熊膽煎煮時間的考察。對采用不同煎煮時間的熊膽原液及其與處方藥品混合的處方液進行試驗發(fā)現(xiàn),煎煮10min、20min、30min對兔角膜上皮細(xì)胞存活率的影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。處方組角膜上皮細(xì)胞存活率均低于熊膽原液組,如圖4所示。

(2)對水提醇沉工藝的考察。水提醇沉采用4因素3水平分析進行考察,結(jié)果顯示各因素及各水平對角膜上皮細(xì)胞的存活率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。提取方法改用直接水提、水提離心、75%醇提,結(jié)果顯示水提醇沉法、水提離心、醇提法3種方法之間沒有差異(P>0.05),但均優(yōu)于水提法(P<0.01),如圖5所示。

(3)合并煎煮時間的考察。將熊膽原液與其它藥品的混合液煎煮0~30min對兔角膜上皮細(xì)胞毒性的影響沒有差異(P>0.05),當(dāng)混合煎煮達(dá)60min時,樣品對兔角膜上皮細(xì)胞毒性明顯減小(P<0.01)。

2.3 刺激性解決結(jié)果

2.3.1 更換防腐劑

將防腐劑更換為山梨酸(0.15%~0.21%),結(jié)果如圖7所示,進一步增加了滴眼液的細(xì)胞毒性,對刺激性沒有任何緩解作用(P<0.001)。

注:羥苯乙酯用量從左到右依次為0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g;處方中山梨酸用量從左到右依次為1.5g、1.8g、2.1g。

2.3.2 降低防腐劑用量

將防腐劑用量分別調(diào)整至0.02%,0.04%,0.06%與原配方0.08%比較。結(jié)果如圖7所示,降低防腐劑的用量能減輕其細(xì)胞毒性,具備一定緩解刺激性的作用(P<0.05)。

2.3.3 添加羧甲基纖維素鈉

由圖8可知,當(dāng)羧甲基纖維素鈉的含量達(dá)到0.20%時,細(xì)胞存活率顯著增加,刺激性減小,推測羧甲基纖維素鈉含量達(dá)到0.30%刺激性將進一步降低,但由于該濃度滴眼液粘度過大不利于臨床應(yīng)用,所以舍棄了該濃度樣品。由圖8還知,含羧甲基纖維素鈉0.20%~0.25%的熊膽滴眼液刺激性明顯降低(P<0.01)。

注:羧甲基纖維素鈉含量從左到右依次為0.05%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%;增粘劑透明質(zhì)酸鈉從左到右依次為0.02%,0.04%,0.08%,0.10%,0.20%,0.30%,0.40%。

2.3.4 添加透明質(zhì)酸鈉

如圖8可知,透明質(zhì)酸鈉含量在0.02%~0.40%對熊膽眼藥水的刺激性沒有明顯改善作用,相反可能會增加滴眼液的刺激性(P>0.05)。

3 討論

(1)羥苯乙酯與熊膽原液同時存在時,角膜上皮細(xì)胞存活率大大降低,且當(dāng)羥苯乙酯加入熊膽原液后,熊膽原液澄明度明顯增加,提示二者結(jié)合可能產(chǎn)生了某種化學(xué)反應(yīng),生成了細(xì)胞毒性更大的物質(zhì),需要采用進一步手段進行分析研究。

(2)該研究表明加入一定量的羧甲基纖維素鈉能夠明顯改善其對角膜上皮細(xì)胞的毒性,而添加透明質(zhì)酸鈉則沒有任何改善。推測羧甲基纖維素鈉通過化學(xué)或物理作用減輕了膽酸成分刺激性。但熊膽眼藥水的藥理作用是否有所改變有待進一步研究。

(3)有研究表明,滴眼液中常用防腐劑山梨酸、苯扎溴銨和羥苯乙酯均具有一定的角膜上皮細(xì)胞毒性,其中苯扎溴銨毒性最大,羥苯乙酯毒性最小[6]。本研究采用山梨酸替代羥苯乙酯進行實驗研究,結(jié)果顯示其對熊膽眼藥水的刺激性改善不明顯,盡管有報道稱透明質(zhì)酸鈉對由防腐劑造成的細(xì)胞毒性有明顯改善作用[6],提示熊膽眼藥水刺激性的產(chǎn)生不單純依靠羥苯乙酯實現(xiàn)。這與研究中單用PBS配制不同濃度羥苯乙酯進行實驗其細(xì)胞毒性較小的現(xiàn)象一致。

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(責(zé)任編輯:陳涌濤)

Study on the Irritation of SS Xiongdan Eye Drop

Xiao Dan,Liu Tianqiang,He Jian,Dong Ziliang

(Chengdu University of TCM, Sichuan, Chengdu 610075, China)

Abstract:Objective: Using a new irritation test established in this study to screen the cause of the irritation of SS Xiongdan eye drop (SS eye drop) and adopting proper approach to solve this problem. Methods: 4 kinds of Xiongdan eye drops were tested by the SIRC-MTT and the scores were compared with clinical evaluation, the cause of irritation of Diao eye drop was studied by the method of SIRC-MTT. Results: The correlation coefficient between SIRC-MTT score and clinical evaluation score was 0.961, whichshowed that SIRC-MTT is an effective method to evaluate irritation of Xiongdan eye drops. The cause of strong irritation of Diao eye drop is the coexistence of xiongdan liquid and ethylparaben. Decreasing the dosage of the ethylparaben (0.04) or adding CMC-Na (0.2%~0.25%)could increase the Corneal epithelial cell survival rates. Conclusion: SIRC-MTT is an effective method to evaluate irritation in vitro. Decreasing the dosage of the ethylparaben or adding CMC-Na can ease the irritation of the Diao eye drop.

Key words:Irritation;SIRC;Cytotoxicity test;SS Xiongdan Eye Dop