林鐘石 徐良 鐘文雨

摘要：目的? 評價金屬鋁的細胞毒性、刺激性和皮膚致敏性，為金屬鋁材料在醫(yī)療器械領域的制造和應用提供安全依據(jù)。方法? 本研究模擬金屬鋁材料在醫(yī)療器械中的常規(guī)應用，采用拋光處理后的金屬鋁片評估該金屬鋁片的細胞毒性和刺激致敏性。細胞毒性試驗選用濃度1×105個/ml生長良好的L929小鼠成纖維細胞懸液使用MTT法檢測，并計算細胞存活率;刺激試驗將9只新西蘭兔通過完全隨機分成樣品極性浸提液和空白對照組、樣品非極性浸提液和空白對照組和陽性對照組，每組3只。將受試液滴到紗布上，貼敷于脊柱兩側(cè)固定4 h后去除，觀察水清洗后1、24、48和72 h皮膚表面，計算原發(fā)性刺激并后確定反應類型;皮膚致敏試驗將50只豚鼠通過完全隨機分成樣品極性浸提液組、空白對照組、樣品非極性浸提液組、空白對照組和陽性對照組，每組10只。經(jīng)動物肩膀內(nèi)側(cè)注射受試液皮內(nèi)誘導，觀察貼敷結(jié)束后24 h和48 h受試部位情況及Magnusson和Kligman評級。結(jié)果? 細胞毒性試驗中L929細胞與樣品浸提液接觸24h后與空白對照中的細胞顯微鏡下觀察無形態(tài)上的差異且噻唑蘭檢測存活率大于70%;刺激試驗中，貼敷結(jié)束后1、24、48和72h樣品浸提液的皮膚反應均為無紅斑無水腫;皮膚致敏試驗中，貼敷結(jié)束后24和48 h樣品浸提液的皮膚反應均為無紅斑無水腫。結(jié)論? 樣品浸提液無潛在的細胞毒性、刺激性及皮膚致敏性，金屬鋁的生物安全性符合現(xiàn)有標準對于與完整皮膚接觸和部分與黏膜接觸（≤24 h）的表面器械的生物安全性要求，但其在低pH環(huán)境下的使用，還需要進一步的研究。

關鍵詞：鋁;醫(yī)療器械;細胞毒性;刺激性;皮膚致敏性

中圖分類號：TG113.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.19.019

文章編號：1006-1959（2020）19-0062-06

Abstract：Objective? To evaluate the cytotoxicity， irritation and skin sensitization of metallic aluminum， and provide a safety basis for the manufacture and application of metallic aluminum materials in the field of medical devices.Methods? This study simulates the conventional application of metal aluminum materials in medical devices， and use polished metal aluminum sheets to evaluate the cytotoxicity and irritation sensitization of the metal aluminum sheets. In the cytotoxicity test， a well-growing L929 mouse fibroblast suspension with a concentration of 1×105 cells/ml was used to detect the MTT method， and the cell survival rate was calculated; in the stimulation test， 9 New Zealand rabbits were completely randomly divided into sample polar extracts and blank control group， sample non-polar extract， blank control group and positive control group， 3 in each group. Drop the test solution onto gauze， stick it on both sides of the spine and fix it for 4 h before removing. Observing the skin surface at 1， 24， 48 and 72 h after washing with water， calculate the primary irritation and determine the type of reaction; skin sensitization in the experiment， 50 guinea pigs were completely randomly divided into a sample polar extract group， a blank control group， a sample non-polar extract group， a blank control group and a positive control group， with 10 in each group. Intradermal induction of the test solution was injected into the inside of the animal's shoulder， and the condition of the test site and the Magnusson and Kligman ratings were observed 24 h and 48 h after the application.Results? In the cytotoxicity test， the L929 cells were in contact with the sample extract for 24 h， and there was no morphological difference between the cells in the blank control， and the survival rate of thiazolyl was greater than 70%; In the irritation test， the skin reaction of the sample extract at 1， 24， 48 and 72 h after the application was no erythema and no edema; in the skin sensitization test， the skin reaction of the sample extract at 24 and 48 h after the application all were without erythema and edema.Conclusion? The sample extract had no potential cytotoxicity， irritation and skin sensitization. The biological safety of metallic aluminum meet the existing standards. The biological safety of surface devices that were in contact with intact skin and partly in contact with mucosa （≤24 h） However， its use in a low pH environment requires further research.

Key words：Aluminum;Medical device;Cytotoxicity;Irritation;Skin sensitization

金屬鋁作為大自然最豐富的元素之一，因為其低成本和特殊的機械特性被廣泛用于社會生活? 中[1，2]，含有鋁元素的合金材料還擁有較好的血液相容性和抗菌性[3，4]。但鋁元素超標時會對人體造成傷害，如帕金森氏病和阿爾茲海默氏病[5，6]。有報道? 稱[7]，細胞內(nèi)鋁離子濃度達到250 μmol/L會促使大腦細胞內(nèi)的微管和微管相關蛋白高度磷酸化，這是阿爾茲海默氏病的一個主要臨床病理信號。本研究模擬金屬鋁材料在醫(yī)療器械中的常規(guī)應用，采用拋光處理后的金屬鋁片通過細胞毒性試驗、刺激試驗、皮膚致敏試驗評估該金屬鋁片的細胞毒性和刺激致敏性，為拋光后的金屬鋁材料從醫(yī)療器械監(jiān)管的角度提供安全性依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料? 金屬鋁材料（深圳圣諾醫(yī)療設備有限公司）、L929小鼠成纖維細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）、MEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，美國）、胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美國）、噻唑藍（MTT）（Merck KgaA，德國）、二甲基亞砜（天津市富宇精細化工有限公司）、異丙醇（廣州化學試劑廠）、0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）、棉籽油（Thermo Fisher Scientific，美國）、2，4-二硝基氯苯（Merck KgaA，德國）、弗氏完全佐劑（FCA）（Merck KgaA，德國）

1.2儀器? CO2培養(yǎng)箱（Memmert GmbH，德國）、倒置顯微鏡（Leica Microsystems Dmi8，德國）、酶標儀（Beckman Coulter，美國）。

1.3實驗動物? 選取SPF級白化豚鼠50只，雌雄兼用，雌鼠未產(chǎn)并無孕，體重300～400 g，周齡8周，另選新西蘭兔9只，雌性未產(chǎn)并無孕，體重2.6～? ? ? 2.8 kg，周齡17周，來源廣東省醫(yī)學實驗動物中心，每天供給由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供的飼料和城市生活用水，室溫控制在20 ℃～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%。

1.4方法

1.4.1鋁片浸提液制備? 將金屬鋁（>99.5%）制成? ? 4 cm×4 cm×0.9 cm立方體的鋁片，按照6 cm2/ml的比例分別浸沒入非極性浸提介質(zhì)（棉籽油、含血清培養(yǎng)液）和極性浸提介質(zhì)（生理鹽水、不含血清培養(yǎng)液）中，置于帶蓋的容器中37 ℃條件下振蕩浸提后備用。

1.4.2細胞毒性試驗? 將濃度1×105個/ml生長良好的L929小鼠成纖維細胞懸液接種96孔板，在5%CO2，37 ℃環(huán)境下培育24 h以使細胞形成近匯合狀態(tài)。棄去96孔板中培養(yǎng)液，將陰性對照、空白對照、陽性對照（10%二甲基亞砜）和樣品浸提液（浸提介質(zhì)：含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液）用移液器分別加入96孔板，每孔100 μl。5%CO2，37 ℃環(huán)境下繼續(xù)培育24 h，然后棄去受試液。每孔中加入50 μl MTT溶液，然后再培育2 h。培育結(jié)束后，棄去MTT溶液，每孔中加入100 μl的異丙醇以溶解MTT與活細胞反應生成的甲瓚沉淀。振蕩混勻后，用酶標儀在570 nm波長（參比波長650 nm）下測量每孔溶液的吸光度并計算存活率。

1.4.3刺激試驗? 將9只新西蘭兔通過完全隨機分成樣品極性浸提液和空白對照（極性）組、樣品非極性浸提液和空白對照（非極性）組和陽性對照組（2，4 -二硝基氯苯）共3組，每組3只。去除動物脊柱兩側(cè)被毛并稱重。再將0.5 ml受試液滴到紗布上，貼敷于脊柱兩側(cè)。用封閉性繃帶固定貼敷片4h。貼敷結(jié)束后去除紗布，標記接觸部位，并用水清洗以去除殘留受試液。貼敷結(jié)束后分別在1、24、48和72 h觀察皮膚表面，根據(jù)標準ISO 10993-10 2010中皮膚反應記分系統(tǒng)對水腫反應和皮膚紅斑情況進行記分，計算出原發(fā)性刺激記分，最后確定反應類型。

1.4.4 皮膚致敏試驗? 將50只豚鼠通過完全隨機分成樣品極性浸提液組、空白對照組（極性）、樣品非極性浸提液組、空白對照組（非極性）和陽性對照組共5組，每組10只。經(jīng)動物肩膀內(nèi)側(cè)注射0.1 ml受試液。注射液分別為：溶液1（浸提介質(zhì)與弗氏完全佐劑等比例混合的穩(wěn)態(tài)乳化劑）、溶液2（受試溶液）、溶液3（溶液1和溶液2等比例混合后的穩(wěn)定性乳化劑）。皮內(nèi)誘導6 d后，導入10%的月桂醇硫酸鈉到受試部位。導入后24h，將吸附了受試液的紗布貼敷與誘導注射部位進行局部誘導48 h。誘導結(jié)束后13 d，將吸附了受試液的紗布貼敷于動物的上腹（誘導期未測試部位）24 h。貼敷結(jié)束后分別在24和? 48 h觀察受試部位，再根據(jù)Magnusson和Kligman分級標準進行評級。

1.5評價標準

1.5.1細胞毒性試驗? 活細胞減少導致細胞的活性下降，這與生成的甲瓚的含量有關，從而影響570 nm下測量的吸光度值。按下式計算存活率：存活率（%）=100×OD570e/OD570b，OD570e表示試驗樣品100% 浸提液光密度平均值，OD570b表示空白光密度平均值，如存活率下降到<空白的70%，則具有潛在的細胞毒性。

1.5.2刺激試驗? 在除去敷貼片后1、24、48和72 h分別觀察皮膚反應，對每個接觸部位在每個規(guī)定時間內(nèi)皮膚紅斑和水腫反應情況進行評分，見表1。在72 h評分后，分別將每只動物受試液在24、48和? 72 h引起的全部紅斑和水腫記分相加，再將所有計分之和除以6（兩個試驗/觀察部位，3個時間點）計算出某一動物的原發(fā)刺激指數(shù)。將每只動物全部原發(fā)性刺激記分相加后再除以動物總數(shù)（一般為3）得出試驗樣品原發(fā)性刺激指數(shù)。當采用空白或陰性對照時，計算出對照原發(fā)性刺激記分，將試驗材料原發(fā)性刺激記分減去該記分，即得出原發(fā)性刺激記分。反應類型：0～0.4分極輕微，0.5～1.9分輕度，2～4.9分中度，5～8分重度。

1.5.3皮膚致敏試驗? 除去敷貼片后24和48 h觀察試驗組和對照組動物激發(fā)部位皮膚，參照Magnusson和Kligman分級標準對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行分級并記錄。0級敷貼試驗反應無明顯改變，1級散發(fā)性或斑點狀紅斑，2級中度融合性紅斑，3級重度紅斑和/或水腫。陰性對照組動物等級小于1，而試驗組中等級≥1時一般提示致敏。如陰性對照組動物等級≥1時，試驗組動物反應超過陰性對照組中最嚴重的反應則認為致敏。

1.6統(tǒng)計學方法? 利用Excel軟件對動物實驗進行分組，分組方法采用完全隨機設計。

2結(jié)果

2.1細胞毒性試驗? 鋁片浸提液接觸細胞24 h后細胞胞漿內(nèi)有離散顆粒，無細胞溶解。與空白對照中的細胞形態(tài)顯微鏡下觀察無差異，見圖1，而且其存活率大于70%，見圖2，表2，無潛在的細胞毒性。

2.2刺激試驗? 刺激試驗貼敷結(jié)束后1、24、48和? 72 h，兩組樣品浸提液和對照組動物皮膚在觀察期內(nèi)的反應均為無紅斑、無水腫，并未發(fā)現(xiàn)皮膚部位的其他異常情況，反應記分均為0分，確定反應類型為極輕微，見表3、圖3。

2.3皮膚致敏試驗? 貼敷結(jié)束后24 h和48 h，兩組樣品浸提液組動物皮膚無明顯改變，反應分級均為0級，未觀察到致敏反應，見表4、圖4。

3討論

醫(yī)療器械按照其生物安全要求從低到高被分為表面器械、外部接入器械和植入器械3大類，每個大類下又按照與人體的接觸時間長短分為了短暫接觸（≤24 h）、長期接觸（>24 h～30 d）和持久接觸（>30 d）3個小類。醫(yī)療器械的生物安全等級要求越高，與人體接觸時間越長，其需要評價的生物學評價終點就越多。同理，相關生物材料能夠滿足的生物學安全性評價終點越多，其能被應用于醫(yī)療器械的范圍就越廣。細胞毒性和刺激性和皮膚致敏性是現(xiàn)行國際法規(guī)標準對醫(yī)療器械及其材料生物安全性的基礎要求。根據(jù)ISO 10993-1，生物安全性能夠滿足這3項生物安全性評價終點的生物材料能夠被應用于與完整皮膚接觸和部分與黏膜接觸（≤24 h）的表面器械。

細胞毒性試驗按照與樣品與細胞的接觸方式分為直接接觸法、間接接觸法和浸提液法。其中間接接觸法只適合于對生物材料細胞毒性初篩的定性評價，能夠?qū)ι锊牧线M行準確的定量評價的只有直接接觸法和浸提液法。然而，金屬材料的密度較大，在直接接觸法中會導致材料下方的細胞機械性損傷，會產(chǎn)生細胞毒性的假陽性結(jié)果。因此本研究采用浸提液法作為金屬鋁材料的細胞毒性評價手段。皮膚致敏試驗也分為3種，分別為豚鼠最大劑量試驗、封閉式貼敷試驗和小鼠局部淋巴結(jié)試驗，其中豚鼠最大劑量試驗為最為最敏感的皮膚致敏性檢測手段，而且適用于不能滲透皮膚的金屬物質(zhì)的評價，因此，本研究中選擇豚鼠最大劑量試驗作為金屬鋁材料皮膚致敏性評價手段。

由于鋁元素對人體的神經(jīng)會產(chǎn)生傷害，國內(nèi)外鮮有關于金屬鋁在醫(yī)療器械方面應用的研究。然而當金屬鋁材料暴露于大氣中時，由于鋁的性質(zhì)非常活潑，會在其表面形成一層氧化鋁的保護膜厚度，厚度約為0.5～4 μm，而氧化鋁在國內(nèi)外的研究報道中都具有良好的生物安全性。Kahbasi S等[8]用人真皮成纖維細胞和人成骨細胞與包裹了氧化鋁外殼的納米微球接觸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化鋁有著很好的生物相容性。Kahbasi S等[9]將氧化鋁納米微球的浸提液與人紅細胞接觸，沒有觀察到明顯的溶血現(xiàn)象。Alejandro Carnicer-Lombarte A等[10]測定了一種以氧化鋁為主要成分的電極片的體外生物安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該電極片對L929小鼠成纖維細胞和PC-12神經(jīng)細胞都沒有毒性。王佳寧將氧化鋁陶瓷復合材料與人牙周膜細胞接觸，沒有觀察到氧化鋁對人牙周膜細胞的細胞增殖、凋亡和骨誘導活性有任何影響[11]。此外，氧化鋁由于其化學惰性、高強度和硬度也被廣泛的用于牙科植入物和外科假體[12]。

本研究采用細胞毒性試驗、刺激試驗和皮膚致敏試驗觀察了金屬鋁材料的生物安全性，結(jié)果表明，金屬鋁材料作為生物材料能夠滿足現(xiàn)行法規(guī)標準對與完整皮膚接觸和部分與黏膜接觸（≤24 h）的表面器械的生物安全性要求。由此推測，金屬鋁在表面自然氧化形成的這層氧化鋁的保護膜能一定程度上防止金屬鋁中鋁元素的釋出，從而使金屬鋁具有一定的生物安全性。但Hashimoto M等[13]將氧化鋁納米微球與巨噬細胞RAW264接觸時，發(fā)現(xiàn)在低pH的環(huán)境下，氧化鋁也會釋放鋁離子從而干擾細胞的正常功能。因此，金屬鋁材料如果作為在低pH環(huán)境下使用的醫(yī)療器械，例如胃腸道內(nèi)窺鏡，其毒性作用還需進一步研究。此外，由于金屬鋁材料天然形成的氧化膜厚度較薄，且耐磨性和抗腐蝕性較差，如若要增加金屬鋁材料的生物安全性，可以通過陽極氧化[14]、等離子體噴涂[15]等方法增加其表面氧化鋁保護膜的厚度和強度。

根據(jù)上述的研究，拋光后的金屬鋁材料能夠滿足現(xiàn)行國際法規(guī)標準對于與完整皮膚接觸和部分與黏膜接觸（≤24 h）的表面器械的生物安全性要求，但在低pH環(huán)境下的毒理作用還需要進一步研究。

參考文獻：

[1]Barceló J，Poschenrieder C.Fast root growth responses，root exudates，and internal detoxification as clues to the mechanisms of aluminium toxicity and resistance：a review[J].Environmental&Experimental Botany，2002，48（1）：75-92.

[2]Krejpcio Z，Wojciak.The Influence of Al 3+Ions on Pepsin and Trypsin Activity in Vitro[J].Polish Journal of Environmental Studies，2002（11）：251-254.

[3]Gugala N，Lemire JA，Turner RJ.The efficacy of different anti-microbial metals at preventing the formation of，and eradicating bacterial biofilms of pathogenic indicator strains[J].Journal of Antibiotics，2017，70（6）：775-780.

[4]Tanaka Y，Kurashima K，Saito H，et al.In vitro short-term platelet adhesion on various metals[J].Journal of Artificial Organs，2009，12（3）：182-186.

[5]Liu Y，Bi A，Gao T，et al.A novel self-assembled nanoprobe for the detection of aluminum ions in real samples and living cells[J].Talanta，2018（194）：38-45.

[6]Chen YC，Lee IL，Sung YM，et al.Colorimetric detection of Al3+ions using triazole-ether functionalized gold nanoparticles[J].Talanta，2013，117（Complete）：70-74.

[7]Shevtsov PN，Shevtsova EF，Savushkina OK，et al.Influence of Al3+， Fe3+ and Zn2+ Ions on Phosphorylation of Tubulin and Microtubulo-Associated Proteins of Rat Brain[J].Bulletin of Experimental Biology&Medicine，2018，165（4）：512-515.

[8]Mestres G，Espanol M，Xia W，et al.Evaluation of Biocompatibility and Release of Reactive Oxygen Species of Aluminum Oxide-Coated Materials[J].ACS Omega，2016，1（4）：706-713.

[9]Kahbasi S，Samadbin M，Attar F，et al.The effect of aluminum oxide on red blood cell integrity and hemoglobin structure at nanoscale[J].International Journal of Biological Macromolecules，2019（138）：800-809.

[10]Carnicer-Lombarte A，Lancashire HT，Vanhoestenberghe A.In vitro biocompatibility and electrical stability of thick-film platinum/gold alloy electrodes printed on alumina[J].J Neural Eng，2017，14（3）：36012.

[11]王佳寧.氧化鋯氧化鋁陶瓷復合材料對人牙周膜細胞增殖、凋亡和骨誘導活性的影響[J].中國組織工程研究，2017，21（26）：4155-4159.

[12]Wong HM，Zhao Y，Tam V，et al.In vivo stimulation of bone formation by aluminum and oxygen plasma surface-modified magnesium implants[J].Biomaterials，2013，34（38）：9863-9876.

[13]Hashimoto M，Imazato S.Cytotoxic and genotoxic characterization of aluminum and silicon oxide nanoparticles in macrophages[J].Dental Materials，2015，31（5）：556-564.

[14]Ekwe NB，Aloko DF.Anodization of Aluminum[J].International Journal of Scientific and Research Publications（IJSRP），2013，3（3）：1-3.

[15]Khalid M，Mujahid M，Khan AN，et al.Plasma Sprayed Alumina Coating on Ti6Al4V Alloy for Orthopaedic Implants：Microstructure and Phase Analysis[J].Key Engineering Materials，2012（510-511）：547-553.

收稿日期：2020-08-06;修回日期：2020-08-14

編輯/肖婷婷