王有剛 李新慶 李春和 吳智遠(yuǎn) 崔磊 劉廣鵬 李宇琳 孫劍

自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組織工程骨修復(fù)顱骨缺損的臨床研究

王有剛 李新慶 李春和 吳智遠(yuǎn) 崔磊 劉廣鵬 李宇琳 孫劍

目的探討人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）作為種子細(xì)胞的組織工程骨修復(fù)外傷后顱骨缺損的可行性。方法自2006年6月至2007年2月，共4例外傷后顱骨缺損患者，抽取患者骨髓，分離得到hBMSCs，體外擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)后，將hBMSCs與部分脫鈣骨復(fù)合，體外共培養(yǎng)1周后，手術(shù)植入顱骨缺損區(qū)。分別于術(shù)后1周和3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行臨床和三維CT檢查隨訪。結(jié)果術(shù)后1周，三維CT均顯示骨缺損區(qū)被所植入的組織工程骨充填；術(shù)后3～6個(gè)月，CT顯示組織工程骨形成并修復(fù)骨缺損，新生骨與骨缺損斷端融合。高齡患者及骨缺損面積過(guò)大患者，組織工程骨體內(nèi)成活率較差。結(jié)論通過(guò)選擇適宜的病例，以自體hBMSCs作為種子細(xì)胞，運(yùn)用組織工程技術(shù)可以在人體內(nèi)形成穩(wěn)定的組織工程骨并可用于修復(fù)顱骨缺損。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組織工程顱骨缺損臨床應(yīng)用

外傷性顱骨缺損臨床較常見(jiàn)，目前多用人造材料或自體骨移植進(jìn)行修復(fù)。人造材料存在免疫排斥反應(yīng)，而自體骨組織移植則存在供區(qū)有限等問(wèn)題[1-5]。近年來(lái)，組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為臨床顱骨缺損修復(fù)提供了新的思路。我們于2006年6月至2007年 2月，以經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)的自體人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow stromal cells,hBMSCs）為種子細(xì)胞、部分脫鈣骨（Partly demineralized bone matrix, pDBM）為支架材料，對(duì)4例外傷后顱骨缺損患者進(jìn)行修復(fù)，取得了較理想的療效。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本組共4例，男、女各2例。年齡最小8歲，最大50歲。4例患者均為外傷性顱骨缺損，缺損面積最小為3 cm×4.5 cm，最大7 cm×8 cm，其中1例為2處缺損。缺損部位分別位于右顳枕部、右額顳部、額部。病程3～15個(gè)月不等。所有患者術(shù)前均行三維CT檢查。

1.2 方法

1.2.1 組織工程骨的體外培養(yǎng)

1.2.1.1 自體hBMSCs的體外培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)

從患者骼后上棘經(jīng)穿刺抽取骨髓10～20 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液上（密度1.073 g/L，Pharmacia公司，美國(guó)），骨髓與分離液的比例為1∶2，2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，以2×107cell/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增，以成骨條件培養(yǎng)液（DMEM，10 mmol/Lβ-磷酸甘油鈉，10～8 mol/L地塞米松，50μmol/L磷酸抗壞血酸，300 mg/L谷氨酞胺和10%胎牛血清）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。原代細(xì)胞接種后48 h換液，達(dá)80%～90%融合后，采用0.25%胰酶消化，以2×103cells/cm2的密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于成骨檢測(cè)，并接種于部分脫鈣骨材料。

1.2.1.2 成骨誘導(dǎo)后hBMSCs的成骨表型鑒定

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，按參考文獻(xiàn)[1]的方法，行第3代細(xì)胞爬片鈣結(jié)節(jié)四環(huán)素?zé)晒馊旧?/p>

1.2.1.3 hBMSCs復(fù)合pDBM體外培養(yǎng)

pDBM由上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心制備，孔隙率80%～85%，脫鈣程度約為30%～35%[6]。成骨誘導(dǎo)后的hBMSCs以3.5×107cells/mL的濃度接種于pDBM（其規(guī)格大小按患者術(shù)前三維CT檢測(cè)結(jié)果，參照正常側(cè)來(lái)確定骨缺損范圍)[4]，體外繼續(xù)成骨培養(yǎng)1周，鏡下觀察細(xì)胞在pDBM上生長(zhǎng)情況?；刂睬? d，換用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)[2]。

1.2.2 手術(shù)方法

手術(shù)均在全麻下進(jìn)行。按神經(jīng)外科常規(guī)開(kāi)顱手術(shù)方法，暴露骨缺損區(qū)，徹底止血，然后將細(xì)胞材料復(fù)合物拼接，并完全覆蓋顱骨缺損區(qū)，使細(xì)胞材料復(fù)合物邊緣和周?chē)９敲芮薪佑|，用可吸收縫線將細(xì)胞材料復(fù)合物與周?chē)墙M織固定后，頭皮下置負(fù)壓引流，嚴(yán)密縫合軟組織，關(guān)閉創(chuàng)面。術(shù)后使用抗生素3～5 d。

1.2.3 組織工程骨體內(nèi)成骨的評(píng)價(jià)

分別于術(shù)后1周和3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行臨床（術(shù)前、術(shù)后照片）對(duì)比和三維CT檢查隨訪，對(duì)治療效果進(jìn)行近、中期評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs的體外形態(tài)觀察和生長(zhǎng)規(guī)律

原代細(xì)胞接種24 h后，倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)hBMSCs貼壁，呈紡綞形，核大，核仁清晰，以集落樣方式生長(zhǎng)。10～14 d后細(xì)胞已大部分融合，并且細(xì)胞體積逐漸增大，向多角形轉(zhuǎn)變。全部患者均分離得到自體hBMSCs，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)并擴(kuò)增至第3代，平均擴(kuò)增（163±13）倍，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[3]。

2.2 hBMSCs成骨表型的鑒定

經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，hBMSCs有鈣結(jié)節(jié)沉著且熒光染色陽(yáng)性。

2.3 細(xì)胞材料復(fù)合物體外共培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察,pDBM有良好的細(xì)胞相容性，hBMSCs接種于pDBM后3～4 h可見(jiàn)hBMSCs貼附生長(zhǎng)，細(xì)胞在pDBM孔隙中粘附良好；5～8 d可見(jiàn)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)充滿pDBM孔隙。

2.4 臨床治療結(jié)果

術(shù)后早期，2例患兒出現(xiàn)頭皮下積液，其中1例患兒術(shù)后5 d于左額部（非手術(shù)區(qū)）頭皮下抽出血性積液10 mL后未再出現(xiàn)積液；另1例術(shù)后3 d于右顳枕區(qū)（手術(shù)區(qū)）頭皮下積液，經(jīng)連續(xù)2次穿刺分別抽出15 mL淡咖啡色積液，術(shù)后3周時(shí)未再出現(xiàn)積液。

全部病例術(shù)后1周，三維CT顯示骨缺損區(qū)被組織工程骨充填，頭顱外形明顯改善。1例50歲女性患者，術(shù)后3個(gè)月CT顯示組織工程骨大部分被吸收（圖1）。其余患者術(shù)后3個(gè)月時(shí)，可見(jiàn)植入的細(xì)胞材料復(fù)合物形成高密度影，但較周?chē)ｏB骨密度稍低，組織工程骨和鄰近骨組織大部分融合，但部分連接區(qū)域有少量骨吸收現(xiàn)象，提示組織工程骨形成并基本修復(fù)骨缺損。術(shù)后6個(gè)月，CT顯示組織工程骨和鄰近骨融合，其中1例大面積顱骨缺損患兒修補(bǔ)中心區(qū)部分被吸收，周?chē)苫顓^(qū)呈高密度影，與正常骨融合良好（圖2）。

圖2 大面積顱骨缺損患兒修補(bǔ)中心區(qū)部分被吸收，周?chē)苫顓^(qū)與正常骨融合良好

3 討論

采用組織工程技術(shù)，以患者自體hBMSCs作為種子細(xì)胞，經(jīng)體外大規(guī)模擴(kuò)增后與部分脫鈣骨（pDBM）形成hBMSCs-pDBM復(fù)合物來(lái)修復(fù)大面積顱骨缺損，能夠避免目前顱骨缺損治療時(shí)自體骨來(lái)源不足、對(duì)自體骨供區(qū)的損傷等缺點(diǎn)，改變了“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的傳統(tǒng)治療模式，為臨床顱骨缺損修復(fù)建立了新的治療模式。

組織工程技術(shù)通過(guò)從少量的骨髓組織中分離得到hBMSCs作為種子細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量后，與支架材料復(fù)合，體外構(gòu)建組織工程骨，來(lái)修復(fù)大面積顱骨缺損。其細(xì)胞能夠維持成骨細(xì)胞特有的生物學(xué)特性，同時(shí)避免了免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能。因此，新生的組織工程骨能與受區(qū)骨組織完全融合，修復(fù)的顱骨具有接近正常的大體外觀與組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并能維持正常的生理功能[6]。

支架材料是組織工程研究的重要因素。本研究中選用的支架為同種異體部分脫鈣骨。通過(guò)脫細(xì)胞、去蛋白、脫鈣等處理，使其抗原性大大降低；而保留了該支架材料特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和膠原成分。實(shí)驗(yàn)表明，該材料有利于細(xì)胞黏附、分化和增殖，細(xì)胞材料相容性較好，植入體內(nèi)后易被宿主骨細(xì)胞取代而降解，能滿足骨組織工程對(duì)基質(zhì)材料的要求[8]。

對(duì)于小兒顱骨缺損，由于人工組織代用品無(wú)法隨患兒生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，修復(fù)手術(shù)往往推遲到成人后進(jìn)行，增加了發(fā)生顱腦再損傷、腦發(fā)育不良、癲癇等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。采用組織工程技術(shù)修復(fù)顱骨缺損畸形，新生的組織工程骨與自體骨融合，可隨患兒生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，故修復(fù)手術(shù)可在小兒時(shí)期進(jìn)行，避免了上述不足。

目前，采用組織工程骨修復(fù)顱骨缺損尚處于起步階段，我們?cè)谂R床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)有許多問(wèn)題亟待解決。首先，高齡患者由于hBMSCs成骨能力與增殖能力較弱，導(dǎo)致細(xì)胞材料復(fù)合物在體內(nèi)降解吸收較快，與新生骨的成骨速度不匹配；其次，在大面積顱骨缺損患者的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，缺損中心區(qū)存在細(xì)胞材料復(fù)合物吸收現(xiàn)象，而周緣區(qū)域能形成良好的組織工程骨，這可能與周?chē)\(yùn)好、中心部分血供較差有關(guān)。

相信隨著組織工程骨研究的進(jìn)一步深入，組織工程骨修復(fù)顱骨缺損將具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

[1]柴崗,張艷,劉偉,等.人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在骨組織工程臨床應(yīng)用中的探討[J].中國(guó)臨床康復(fù),2002,6(22):3340-3341.

[2]柴崗,張艷,王敏,等.人骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和脫鈣骨粘附率的研究[J].實(shí)用美容整形外科雜志,2003,14(2):66-68.

[3]柴崗,張艷,劉偉,等.組織工程骨在顱頜面骨缺損臨床修復(fù)中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83（19）:1676-1681.

[4]柳榮軍.修復(fù)顱骨缺損的材料選擇[J].人民軍醫(yī),2005,48:111-112.

[5]候立軍,盧亦成,于明琨,等.顱骨重建對(duì)創(chuàng)傷性顱骨缺損患者神經(jīng)功能的影響[J].中華創(chuàng)傷雜志,2004,20:772-773.

[6]劉廣鵬,舒朝鋒,尹爍,等.低溫保存對(duì)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在脫鈣骨上體外增殖與成骨能力的影響[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2006, 8:933-937.

[7]曹誼林,周廣東,劉偉,等.組織工程與創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)[J].中華創(chuàng)傷雜志, 2005,21(1):25-28.

[8]張艷,柴崗,麻蓀香,等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4:189-191.

Clinical Application of Auto-hBMSCs Acting as Seeding Cell for Tissue Engineered Bone on the Cranial Defects

WANG Yougang1,LI Xinqing1,LI Chunhe1,WU Zhiyuan1,CUI Lei2,LIU Guangpeng2,LI Yulin2,SUN Jian2.
1 Changzhou Second Hospital Affiliated Nanjin Medical University,Changzhou 213000,China;2 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.Corresponding author:LI Xinqing,CUI Lei.

ObjectiveTo investigate the clinical effect of hBMSCs acting as seeding cell for tissue engineer bone on the cranial defects.MethodsFrom June 2006 to February 2007,four patients with traumatic cranial defect were treated by using auto-hBMSCs acting seeding cellfor tissue engineered bone.Autogenic hBMSCs were isolated,proliferated and induced in vitro,then combined with partially demineralized bone matrix.After co-cultured for 1 week,the cell/scaffold complexes were used for implantation.Gross observation and 3 dimensional CT were performed before and after 1 week and 3,6 months implantation.ResultsThree dimensional CT at 1 week post-implantation showed that the defect was filled with engineered bone,and the gross appearance of skull was obviously improved.After 3 and 6 months,new bone formed and fused with host bone,and the defects were repaired in 3 patients.There was no any osteogenesis in an old patient with large defect.ConclusionAutogenic hBMSCs acting as seeding cell for tissue engineered bone can repair cranial defect.

Human bone marrow stromal cells(hBMSCs);Tissue engineering;Cranial defects;Clinical application

R687.3+4

A

1673－0364（2009）03－0125－03

2009年3月30日；

2009年5月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.002

常州市衛(wèi)生局重大科研課題（ZD200610）。

213000常州市南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院（王有剛，李新慶，李春和，吳智遠(yuǎn)）；200235上海市上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心（崔磊，劉廣鵬，李宇琳，孫劍）。

李新慶，崔磊。