祝聯(lián) 鄒成 朱敏 崔磊 曹誼林

·論著·

組織工程化骨修復(fù)四肢骨缺損的初步臨床研究

祝聯(lián) 鄒成 朱敏 崔磊 曹誼林

目的探索以人自體骨髓基質(zhì)干細胞（H uman bone marrow stromal cells，hBMSCs）為種子細胞構(gòu)建的組織工程骨用于修復(fù)四肢骨缺損的可行性。方法選擇9例四肢骨缺損病例（良性骨腫瘤5例、骨缺損4例）。經(jīng)病人髂前上嵴，穿刺抽取10 mL骨髓，用密度梯度離心法分離得到hBMSCs，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液定向培養(yǎng)、擴增，應(yīng)用第3代的hBMSCs與珊瑚復(fù)合，繼續(xù)在體外培養(yǎng)1周后，手術(shù)植入骨缺損區(qū)。分別在術(shù)后2個月、6個月、12個月和24個月進行臨床觀察和X線檢查。1例病人在二次手術(shù)時，在原骨缺損區(qū)取出少量新生組織活檢，進行組織學(xué)觀察（HE染色）。結(jié)果患者術(shù)后X線檢查顯示，組織工程骨在原位形成新骨，能較好地修復(fù)骨缺損。活檢標本HE染色顯示，局部形成正常松質(zhì)骨組織。結(jié)論以自體hBMSCs為種子細胞，利用組織工程技術(shù)制成的自體組織工程骨可以修復(fù)四肢骨缺損，并且能夠修復(fù)較大的骨缺損，但組織工程骨的臨床成骨效果與植骨床血供密切相關(guān)，目前所使用的組織工程骨植骨方法具有一定的適應(yīng)證。

骨髓基質(zhì)干細胞骨缺損組織工程骨

四肢骨缺損的修復(fù)可以用自體骨移植、同種異體骨移植、重組異種骨移植、人工骨植入等方法，各有優(yōu)缺點，在臨床應(yīng)用時，都有著一定的局限性。骨組織工程研究提供了一種骨缺損修復(fù)的新的治療方式。組織工程骨是將種子細胞hBMSCs在體外定向誘導(dǎo)成骨細胞、大量擴增，再與可降解的生物材料復(fù)合，然后植入體內(nèi)骨缺損處，從而達到修復(fù)的目的。我們在大量前期實驗研究的基礎(chǔ)上，在取得患者的知情同意下，自2003至2005年間，選擇9例四肢骨缺損的病例，開展了組織工程骨的臨床初步應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1．1資料

四肢骨缺損患者9例，男5例，女4例，年齡11～35歲。其中，骨缺損4例，骨囊腫3例，骨巨細胞瘤1例，內(nèi)生軟骨瘤1例（表1）。所有患者術(shù)前均接受X線檢查，明確骨缺損大小及范圍。本治療方法經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過，并與患者簽署知情同意書。

表1 患者臨床資料

1．2組織工程化骨的體外培養(yǎng)

從患者髂前上嵴穿刺抽取10 mL骨髓，置于Percoll分離液（密度1.073 g/L）中，骨髓與分離液的比例為1∶2，2 250 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細胞層，磷酸緩沖液（PBS）洗1次，1 550 r/min離心后棄上清液獲取有核細胞，以2×107cell/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿上，以成骨條件培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中成骨誘導(dǎo)、擴增，成骨條件培養(yǎng)液含β-磷酸甘油鈉（10 nmol/L）、地塞米松(10-8mol/L)、L-ɑ-磷酸抗壞血酸（50μmol/L），1-25（OH）2VD3（10 nmol/L）、L-谷氨酰胺（300 mg/L）的DMEM。原代細胞接種48 h后首次換液，細胞達80%～90%融合后，采用0.25%胰酶消化，2×103cells/cm2傳代。DMEM成骨條件培養(yǎng)液將傳至第2代的骨髓基質(zhì)干細胞制成20×106cells/mL的細胞懸液滴入珊瑚，確保珊瑚被細胞懸液浸勻，且不滲漏，靜置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中4 h后，加入DMEM成骨條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后用于手術(shù)。

1.3 手術(shù)方法

所有患者均采用神經(jīng)區(qū)域阻滯麻醉。按骨科手術(shù)方法顯露病灶，其中骨腫瘤病例采用刮除法去除腫瘤組織（所有刮除物術(shù)后經(jīng)病理檢測都為良性腫瘤組織），囊腔以石炭酸、90%乙醇灼燒處理，再用生理鹽水沖洗。組織工程骨以生理鹽水反復(fù)沖洗后植入骨缺損處。注意充填緊密，不留死腔。最后再用開窗骨片蓋回，表面軟組織嚴密縫合。術(shù)后常規(guī)使用抗生素3～5 d。

1.4 組織工程骨體內(nèi)成骨的評估

所有患者術(shù)后2個月、6個月、12個月、24個月進行臨床檢查與X線復(fù)查，按常規(guī)臨床標準判斷骨愈合情況。

1.5 植入物活檢與組織學(xué)檢測

4號患者由于骨囊腫巨大，先后行兩次組織工程骨的培養(yǎng)。在第一次組織工程化骨手術(shù)植入后3個月再進行第二次植入術(shù)。在第二次手術(shù)時，取出少量前次手術(shù)植入的組織工程骨處的新生物，用4%多聚甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、組織切片和HE染色。

2 結(jié)果

全部病例均進行臨床隨訪（2～24個月，平均11個月）。術(shù)后即時X線片顯示，骨缺損區(qū)得到填充。術(shù)后隨訪結(jié)果表明，組織工程骨被緩慢爬行替代，形成的骨小梁與正常骨小梁無異。植入后所有病例均發(fā)生創(chuàng)口少量的一過性淡黃色滲液，經(jīng)換藥1～3 d后，滲液完全消失。其中1例脛骨骨不連患者出現(xiàn)繼發(fā)感染，創(chuàng)口滲液培養(yǎng)為綠膿桿菌。但X線片顯示脛骨骨不連后外側(cè)有顯著成骨，此例患者10個月后行清創(chuàng)，清除感染組織以及不愈合的組織工程骨，術(shù)中見骨缺損后外側(cè)原植入組織工程骨有顯著的堅硬新骨形成，徹底清創(chuàng)后取自體髂骨植入。隨訪1年后骨不連愈合。

3 典型病例

1號患者，男，29歲，小指中節(jié)內(nèi)生軟骨瘤伴病理性骨折。術(shù)前4周抽取骨髓10 mL，分離得到hBMSCs，體外誘導(dǎo)成骨及擴增。將患指以石膏固定，在等待手術(shù)過程中骨折愈合。手術(shù)中將腫瘤徹底刮除后植入組織工程骨，術(shù)后有創(chuàng)口滲液，經(jīng)換藥后痊愈。術(shù)后1年隨訪，發(fā)現(xiàn)組織工程骨已被爬行替代形成新的自體骨（圖1）。術(shù)后2年隨訪，新生骨無吸收。

3號患者，男，11歲，左肱骨中上段巨大骨囊腫伴病理性骨折。術(shù)前4周抽取骨髓15 mL，分離得到hBMSCs，體外誘導(dǎo)成骨及擴增。將左上臂以“O”型石膏固定，在等待手術(shù)過程中骨折愈合。手術(shù)中將腫瘤徹底刮除后植入組織工程骨，由于骨囊腫巨大，第一次培養(yǎng)得到的組織工程骨僅能填充1/2囊腔。3個月后再抽取15 mL骨髓再次培養(yǎng)，4周后再手術(shù)使用組織工程骨將余下空腔填滿。同時在原骨缺損區(qū)取出少量新生組織活檢示，組織工程化骨在原位形成新骨，HE染色顯示局部形成正常骨小梁組織。術(shù)后有創(chuàng)口滲液，經(jīng)換藥后痊愈。術(shù)后1年隨訪，發(fā)現(xiàn)組織工程骨已有2/3被爬行替代形成新的自體骨（圖2）。術(shù)后2年隨訪，骨髓腔形狀良好，無異常增生組織。

圖1 1號患者骨缺損處被修復(fù)

圖2 3號患者經(jīng)過二次組織工程骨充填，骨缺損處被修復(fù)

4 討論

骨腫瘤切除、骨不連均會出現(xiàn)骨缺損，需要植骨治療?，F(xiàn)在，四肢骨缺損的修復(fù)主要有自體骨移植、同種異體骨移植、重組異種骨移植、人工骨植入等4種方法。其中，自體骨移植療效最佳，但也存在創(chuàng)口感染、血腫形成、神經(jīng)損傷、取骨區(qū)疼痛、繼發(fā)骨折等諸多并發(fā)癥。同種異體骨移植、重組異種骨移植雖然避免了自體骨移植的缺陷，但成骨效果較差、有排斥反應(yīng)，并存在被病毒感染的風(fēng)險。人工骨成骨效果最差。1993年，Vacanti等[1]將牛成骨細胞接種在聚羥基乙酸上，植于裸鼠皮下，形成組織工程骨，證明了組織工程骨成骨的可行性。2000年，Petite等[2]利用BMSCs復(fù)合珊瑚修復(fù)了羊跖骨缺損。2001年，本實驗室以BMSCs復(fù)合藻酸鈣修復(fù)了羊顱骨缺損和犬牙槽骨缺損[3]，并在2003年以hBMSCs復(fù)合部分脫鈣骨修復(fù)11例顱骨骨缺損患者[4]。2003年，祝聯(lián)等[5]以BMSCs復(fù)合珊瑚修復(fù)了山羊股骨骨缺損。這些都證明了組織工程骨修復(fù)四肢骨缺損的可行性。但是，組織工程骨用于修復(fù)四肢負重骨，在力學(xué)上要求組織工程骨具有一定的力學(xué)強度。因此，我們使用珊瑚作為成骨細胞載體。因為，珊瑚的孔隙率符合成骨細胞的生長、增殖的要求，并且珊瑚的力學(xué)強度較高，與松質(zhì)骨相類似，有較高的壓應(yīng)力與較低的張應(yīng)力，基本可以滿足肢體負重要求[6]。但是，本組患者中有1例肱骨骨囊腫伴病理性骨折的患者，在術(shù)后有骨干輕度成角（5°）的現(xiàn)象。這提示我們，在組織工程骨緩慢爬行替代的過程中，局部可能出現(xiàn)力學(xué)強度降低的現(xiàn)象。

在臨床應(yīng)用時，本組患者都出現(xiàn)了一過性的組織滲液反應(yīng)，估計可能與組織排斥反應(yīng)有關(guān)。盡管組織工程骨采用hBMSCs，理論上不會產(chǎn)生組織排斥，但組織工程骨內(nèi)殘存少量細胞培養(yǎng)所用的異種血清可能引起組織排斥反應(yīng)。對此反應(yīng)，處理上應(yīng)及時換藥，同時使用抗生素預(yù)防感染。

我們觀察到，組織工程骨的成活與局部血供有很大的關(guān)系。對于骨腫瘤清除后造成的骨缺損，由于組織工程骨填充于骨髓腔內(nèi)，局部血供豐富，故5例病例均獲得成功。6號脛骨骨缺損的病例，由于脛骨中下段位于皮下，其前內(nèi)側(cè)的血供較差，而后外側(cè)為肌肉包繞，血供良好。所以，在后外側(cè)我們觀察到了組織工程骨存活，被爬行替代；而前內(nèi)側(cè)植入的組織工程骨未能成活，又因為組織排斥反應(yīng)繼發(fā)感染，不得不行二次手術(shù)。術(shù)中見到前內(nèi)側(cè)組織工程骨與植入時相仿，骨塊松動且有炎性反應(yīng)，這可能是由于感染使得組織工程骨中的細胞喪失了活力。因此，我們在二次手術(shù)時，清除了前內(nèi)側(cè)的組織工程骨，植入自體髂骨，1年后患者痊愈。

我們認為，組織工程骨的大小與成骨速度成反比。組織工程骨塊越大，其與周圍血液交換營養(yǎng)物質(zhì)的表面積就愈小，故成骨速度不及小塊的組織工程骨。1例肱骨巨大骨囊腫患者，曾經(jīng)以不同顆粒大小的組織工程骨填充，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小塊的組織工程骨愈合成骨的速度明顯快于大塊的組織工程骨。這與臨床上出現(xiàn)的松質(zhì)骨成骨速度快于大塊骨現(xiàn)象的原理是一致的。

通過組織工程骨的初步臨床應(yīng)用，可以得出以下結(jié)論：組織工程骨可以修復(fù)四肢骨缺損，但組織工程骨的成骨依賴于植骨床的血供，血供差將導(dǎo)致組織工程骨失去后繼營養(yǎng)，使植入失?。唤M織工程骨骨塊愈小，成骨速度愈快。

[1]Vacanti CA,Kim WS,Mooney D,et al.Tissue engineered composites of bone and cartilage using synthetic polymers seeded with two cell types[J].Orthop Trans,1993,18:276.

[2]Petite H,Viateau V,Bandsaid W.Tissue-engineered bone regeneration [J].Nat Biotechnol,2000,18:959-963.

[3]Shang Q,Wang Z,Liu W,et al.Tissue-engineered bone repair ofsheep cranial defects with autologous bone marrow stromal cells [J].J craniofal Surg,2001,12:586-593.

[4]柴崗,張艷,劉偉,等.組織工程骨在顱頜面骨缺損臨床修復(fù)中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83:1676-1681.

[5]祝聯(lián),崔磊,王敏,等.應(yīng)用珊瑚及骨髓基質(zhì)干細胞復(fù)合物修復(fù)股骨缺損的實驗研究[J].中華骨科雜志,2003,23:483-488.

[6]祝聯(lián),曹誼林,崔磊.骨衍生材料—珊瑚的研究進展[J].臨床骨科雜志,2001,4:233-235.

《組織工程與重建外科》雜志2009年征稿、征訂通知

《組織工程與重建外科》雜志（Journal of Tissue Engineering and Reconstructive Surgery)是由上海交通大學(xué)主管、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院主辦的綜合性醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊，國內(nèi)統(tǒng)一連續(xù)出版物號：CN31-1946/R，標準刊號：ISSN1673-0364。國內(nèi)外公開發(fā)行。

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《組織工程與重建外科》雜志編輯部

A Preliminary Experimental Study on Repairing Defects of Extremities Using Tissue Engineer Bone

ZHU Lian1, ZOU Cheng2,ZHU Min2,CUI Lei1,CAO Yilin1.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Department of orthopedics,Hangzhou First People′s Hospital,Hangzhou 310006,China.Corresponding author:CAO Yilin.

ObjectiveTo explore the feasibility of human bone marrow stromal cells(hBMSCs)and its clinical repair of limb bone defects.MethodsNine patients of bone defects(5 bone tumors,4 bone defects)were included in this study.The hBMSCs were isolated by Percoll gradient centrifugation with bone marrow aspirated from iliac crest of each patient.hBMSCs were cultured in vitro and induced to become osteogenic cells in the DEME medium containing 10%self-serum,βglycerophosphate(10 nmol/L)dexamethasone(10-8 mol/L),L-2-ascorbic acid(50μmol/L),and 1-25(OH)2VD3(10 nmol/L). Induced hBMSCs of third passage were harvested and seeded into coral to form cell-scaffold construct and in vitro co-culture for one week.The bone defects were repaired with the cell-scaffold construct.All cases were followed up by X-ray and clinical examination at 2,6,12,24 months post-operation.In one case who received second surgery,a piece of tissue was harvested at the implantation site for histological examination.Results The X-ray examination showed that bone defects were repaired well.HE staining revealed the structure of new-born tissue were similar to that of normal bone.ConclusionEngineered bone can be used to repair clinical bone defect of limbs,and can repair large bone defects.But the bone-forming of tissue engineered bone is relative to the blood supply in bone implanting bed.

Bone marrow stromal cell;Bone defect;Tissue engineering bone

R687.3+4，R738.1

A

1673－0364（2009）03－0121－04

2008年12月31日；

2009年3月3日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.001