劉 兵

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

歐 微

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

劉洪濤

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

胎鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與分化

劉 兵

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

歐 微

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

劉洪濤

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探索從胚胎小鼠額葉皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法。方法：無菌條件下分離孕13～15d小鼠胚胎額葉皮質(zhì)腦組織，經(jīng)消化及機(jī)械吹打成單細(xì)胞后接種于含有B27、bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴(kuò)增；倒置顯微鏡觀察比較生長(zhǎng)狀況；機(jī)械分離法傳代；10%血清接種分化；免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的分化方向，結(jié)果：培養(yǎng)的部分細(xì)胞體外分裂增殖，同時(shí)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原nestin， 并向神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分化。結(jié)論：小鼠胚腦存在具有多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，它們能在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代和分化，為細(xì)胞替代治療提供了理想的細(xì)胞來源。

神經(jīng)干細(xì)胞；培養(yǎng)；分化；胎鼠

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一類廣泛存在于胚胎及成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期未分化細(xì)胞，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)的“發(fā)源地”[1]。近年來隨著對(duì)NSCs研究的深入，利用NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性疾病越來越受到廣泛的關(guān)注[2]。如何將神經(jīng)干細(xì)胞在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代，不僅可以為體外研究神經(jīng)干細(xì)胞的分化打基礎(chǔ)，而且可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞替代治療的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)在無血清培養(yǎng)條件下，利用特定的生長(zhǎng)因子使胎鼠NSCs穩(wěn)定增殖傳代并分化出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為進(jìn)一步探討小鼠胚胎NSC移植的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕13～15d昆明小鼠(E13-E15 SPF級(jí))由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑與抗體 DMEM/F12培養(yǎng)基，特優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS),B27均購(gòu)自GIBCO公司(USA)；堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購(gòu)自SIGMA公司(USA)。羊抗鼠anti-nestin，anti-NSE，anti-GFAP的單克隆一抗體及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余試劑均為市購(gòu)。一次性培養(yǎng)皿(直徑60mm)和24孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2方法

1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與分化 取孕13～15d昆明小鼠，斷頸處死，75%酒精浸浴2min，無菌剖腹取出胚胎，浸于預(yù)冷0.01M PBS中，解剖顯微鏡下分離胎腦，PBS洗2次，剝盡腦膜，切取額葉腦皮質(zhì)組織塊(每次用胚胎6～8只)。將取下組織轉(zhuǎn)移至試管中，予以0.25%胰酶(Trypsin)和DNA酶37℃恒溫?fù)u床(150rpm)消化5min，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吸管輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，1 000rpm離心10min,棄上清，以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基再次重懸，200目尼龍網(wǎng)過濾，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度以3×105個(gè)活細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，加2%B27、10ng/ml bFGF于37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)1周左右，采用機(jī)械方法分離傳代細(xì)胞，離心棄上清液，重懸，計(jì)數(shù)接種。一般7d左右傳代一次。取傳2～3代的神經(jīng)干細(xì)胞克隆,置入裝有1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,在僅在含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中自然分化，均每2～3d換液，培養(yǎng)10d后收獲細(xì)胞。

1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 將神經(jīng)干細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基種植到多聚賴氨酸包被的載玻片上，對(duì)貼壁3h的神經(jīng)球進(jìn)行Nestin染色。對(duì)有血清培養(yǎng)1周的神經(jīng)球進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色。檢測(cè)方法如下：取出待檢細(xì)胞，純甲醇-20℃固定20min，PBS洗3次，每次5min，0.5%TritonX-100透化20min，PBS洗3次；3%H2O2和羊血清孵育封閉非特異性反應(yīng)，PBS洗3次；一抗分別為Nestin.NSE.GFAP.4℃過夜，次日加入標(biāo)記有Cy3熒光素或FITC熒光素的二抗，37℃孵育1h；PBS洗3次，緩沖甘油封片，日本OLYPUS顯微鏡和德國(guó)Lacai共聚焦顯微鏡拍片觀察。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分化情況原代培養(yǎng)的皮質(zhì)干細(xì)胞在含B27及bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，早期胞體較小，圓形，未見突起，光鏡下折光性好，晶亮；24h可見大部分細(xì)胞沉底，無突起，由于取材僅限額葉皮質(zhì)細(xì)胞間比較干凈；36h可見沉底的細(xì)胞形成5～10個(gè)細(xì)胞的聚集體；2天可見聚集體增大，懸浮，形成十幾個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球(neurosphere)(見第77頁彩色圖版Ⅰ之圖1),以后細(xì)胞球繼續(xù)增大，5～7d細(xì)胞球直徑可達(dá)20～25μm(×100)，此時(shí)神經(jīng)球約50～100個(gè)/cm2, 球體均勻致密，細(xì)胞晶瑩透亮，周邊可見明顯分裂相細(xì)胞；繼續(xù)生長(zhǎng)球體增大，中央出現(xiàn)黃褐色，為營(yíng)養(yǎng)缺乏所致。也提示需立即傳代處理。皮質(zhì)NSCs傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)性狀基本同原代。將培養(yǎng)的神經(jīng)球移入含有血清的培養(yǎng)基中，3h即可看到細(xì)胞貼壁，12h即可看到細(xì)胞球呈放射狀的生長(zhǎng)并伸出細(xì)長(zhǎng)突起，隨著時(shí)間延長(zhǎng)突起也延長(zhǎng)增多、球體之間形成纖維網(wǎng)絡(luò)；3d左右形態(tài)明顯的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞從貼壁細(xì)胞球遷移出來，有長(zhǎng)突起和網(wǎng)狀神經(jīng)纖維聯(lián)系，皮質(zhì)神經(jīng)球體2周左右可完全分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。

2.2皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞球分化后細(xì)胞類型的鑒定胚鼠額葉皮質(zhì)體外培養(yǎng)的原代及傳代形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光染色顯示神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(nestin)抗原呈陽性(見第77頁彩色圖版Ⅰ之圖2)，表明它們屬于神經(jīng)干細(xì)胞。對(duì)神經(jīng)球分化14d的子代細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色，可見NSE和GFAP免疫熒光陽性細(xì)胞(見第77頁彩色圖版Ⅰ之圖3、圖4)，說明神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有多向分化的潛能。

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞。它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs存在胚胎和成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。在成年哺乳動(dòng)物和晚期胚胎中，NSCs 存在的部位和數(shù)量都較少，而在早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs則廣泛存在。因此取孕13～15d胚鼠額葉皮質(zhì)組織培養(yǎng)得到NSCs成功率較高，易獲得大量高純度的NSCs。

本實(shí)驗(yàn)在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加bFGF促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是少突膠質(zhì)細(xì)胞、施萬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的致有絲分裂原，也能促進(jìn)各種神經(jīng)組織前體細(xì)胞的增殖和分化。不僅如此，bFGF的添加濃度和增殖效應(yīng)密切相關(guān)。開始時(shí)隨著因子濃度的增加，細(xì)胞增殖的速度亦隨之加快，當(dāng)bFGF濃度達(dá)到10～20ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖達(dá)較高水平,之后隨著bFGF濃度增加，細(xì)胞增殖速度反而下降。因此本實(shí)驗(yàn)中bFGF的添加濃度是確定在20ng/ml。另一添加成分B27是培養(yǎng)基添加劑的混合液。B27是一種很強(qiáng)的抗氧化、無血清培養(yǎng)基添加成分，它在神經(jīng)元粘附于基質(zhì)時(shí)能提供必要的一些血清成分。在本實(shí)驗(yàn)中,通過摸索發(fā)現(xiàn)20μg/L 堿性成纖維生長(zhǎng)因子,2% B27組合可以很好的促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的存活與增殖。

Nestin是目前公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物[3]。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)來源于胚鼠額葉皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞成功地進(jìn)行了培養(yǎng)和傳代。培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球，這是神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的重要特征。神經(jīng)球表達(dá)Nestin這種特異性的標(biāo)記物，以及能分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞，證實(shí)了其干細(xì)胞屬性。繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)球進(jìn)一步分化成一些有突起細(xì)胞,漸有突起增長(zhǎng),相互連接成網(wǎng)的現(xiàn)象出現(xiàn),還有的細(xì)胞脫離細(xì)胞球而逐漸分化發(fā)育為較成熟的、可表達(dá)NSE、GFAP抗原的有突起的細(xì)胞,提示額葉來源的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中,神經(jīng)球生長(zhǎng)到一定程度,中央的神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)因缺乏營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)控而死亡。因此在培養(yǎng)一定時(shí)間后,需要分散神經(jīng)球或傳代來保持細(xì)胞的活性。本實(shí)驗(yàn)盡量使用機(jī)械分離法和酶消化法進(jìn)行分散過大的細(xì)胞團(tuán)塊或神經(jīng)球獲取活力較強(qiáng)的細(xì)胞。

總之，如果通過體外培養(yǎng)的方法尋找促使神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的物質(zhì),能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的自身增殖,應(yīng)用于臨床治療,將對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療帶來新的光明。因此,建立分離、培養(yǎng)和鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的方法，為神經(jīng)干細(xì)胞的深入研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

[1]Gage FH.Mammalian neural stem cells[J].Science，2000，287：1433-1435.

[2]朱劍虹.神經(jīng)干細(xì)胞和人腦再生醫(yī)學(xué)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85(3)：2527-2529.

[3] Lendahl U, Zimmerman LB, Mckay RDG.CNS stem cell express a new class ofintermediate filament protein[J].Cell，1990，60：585-595.

[編輯] 一 凡

2009-05-13

劉兵(1973-)，男，湖北荊州人，講師，碩士，從事神經(jīng)生物學(xué)和斷層解剖學(xué)教學(xué)與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.03.004

R322.83

A

1673-1409(2009)03-R008-03