湯蘇陽　蔡寶仁　黃高升　艾玉峰　張琳西

湯蘇陽女，1964年生，1987年畢業(yè)于錦州醫(yī)學院醫(yī)療系，1998期部隊中、青年人才基金班畢業(yè)，醫(yī)學碩士。發(fā)表論文十余篇，參編專著一部。［摘要］目的：研究苦參堿(Matrine,簡稱Mat)對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響。方法：將Mat以不同濃度梯度作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞，測MTT反應的A0值及LDH值，用免疫組織化學檢測Mat用藥前后的細胞核內(nèi)增殖性抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達。結果：增生性瘢痕成纖維細胞在Mat0.25～100mg/ml范圍內(nèi)呈劑量依賴性增殖抑制，但LDH值無明顯改變；PCNA的表達，在Mat作用后明顯減弱。結論：Mat在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖而不引起細胞壞死性改變。

［關鍵詞］苦參堿成纖維細胞增殖

［中圖分類號］R619+.6［文獻標識碼］A［文章編號］1008-6455(2001)01-0006-03

THE INFLUENCE OF MATRINE ON THE GROWTH AND PROLIFERATION

OF SCAR-DERIVED FIBROBLASTS

TANG Su-yangCAI Bao-renHUANG Gao-sheng

Department of burn and plastic,205 Hospital of PLA(Jin Zhou 121001)china

［Abstract］Objective：To study the influence of Matrine on growth and proliferation of fibroblasts derived hgpertropnic scar.〖WT5"HZ〗Methods：The MTT OD value and the content of LDH was examined by biochemical analysis after Matrine was added to the monolayer culture system of scar-derived fibroblasts.The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA)were examinedby immunochemied methed.Results：Mat at 0.10～100.mg/ml could decrease the MTT OD value in dose dependent manner amd could not increase the content of LDH significantly.The expression of PCNA in Mat groupswas highr than the control groups.Conclusion：Mat could inhibit the proliferation of derived hypertropnicscar fibroblasts rarely produce the toxicity on scar-derived fibroblasts.

［Key words］MatrineFibroblastProliferation

增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合的異常結局，可造成機體的形態(tài)改變和功能障礙。故研究創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成的機制及其治療一直是困繞整形外科的難題之一^〔1〕?？鄥㈩惿飰A(Matrice 簡稱Mat)是以苦參堿為代表的、結構相似的一類生物堿。近年來，國內(nèi)外在研究、使用苦參類生物堿的過程中發(fā)現(xiàn)其多方面的藥理活性和臨床功能，如：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的作用，抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化疾病作用^〔2〕?？鄥A也是我科多年以來使用的瘢痕軟化膏的主要成分，其臨床使用效果明顯，能明顯抑制瘢痕的增生，且使增生性瘢痕軟化；目前無苦參堿對人增生性瘢痕作用的報道，但很可能是極具前途的治療瘢痕增生的生物堿。通過體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細胞作為實驗對象，觀察苦參堿對其增殖的影響，為探討苦參堿對瘢痕的治療作用提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料苦參堿標準品：由中國生物制品、藥品檢定所提供；DMEM，胰蛋白酶：由美國Gibco公司生產(chǎn)；新生牛血清：由杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)；DMSO由上海Sangen公司生產(chǎn)；MTT由美國Sigma公司生產(chǎn)。Ⅰ抗鼠抗人PCNA單克隆抗體，Ⅱ抗DokA Envision+〔TM〕購于丹麥DAKO公司，DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法手術中取增生性瘢痕組四例，年齡2～25歲，在無菌條件下經(jīng)漂洗、剪碎，培養(yǎng)于含200ml/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃，CO₂孵箱中培養(yǎng)，待長成致密單層后用2.5g/L胰蛋白酶消化，以1∶3傳代。實驗所用的細胞為第4～9代細胞。實驗分成11組，藥物濃度單位為mg/ml，詳見附表。

1.2.1乳酸脫氫酶(LDH)的測定取對數(shù)生長期細胞，用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種2.5×104個細胞，置CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)7d，每3d換液1次，按分組加入條件培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清，用全自動生化分析儀測定LDH活性值。

1.2.2MTT比色法測定細胞增殖狀況取對數(shù)生長期細胞，在96孔培養(yǎng)板中接種5×10³個細胞+DMEM培養(yǎng)液200μL，置CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)8h，吸棄上清，按分組加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入MTT液10μL/孔振蕩顯色，自動酶聯(lián)免疫分析儀測定A0值。(波長490nm)增殖抑制率(%)=〔1-(實驗組吸光值-對照組吸光值)/對照組吸光值〕×100%^〔3〕。

1.2.3PCNA檢測取對數(shù)生長期細胞，將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，每孔接種5×104個細胞，于CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，分2組分別加入0.5～1.0mg/ml苦參堿條件培養(yǎng)液和空白加培養(yǎng)液組；培養(yǎng)24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性樹脂粘片，PBS沖洗振蕩三次，每次5min，用1%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，甩干加Ⅰ抗，4℃過夜，復溫1h，PBS沖洗振蕩三次，每次5min。甩干加Ⅱ抗，放置37℃1h后，PBS沖洗振蕩3次，每次5min。甩干，DAB顯色。

2結果

2.1苦參堿對增生性瘢痕成纖維細胞乳酸脫氫酶(LDH)和增殖的影響ゼ尤肟嗖渭24h后，G1-G8各組中LDH值與對照組C比無顯著差異(P＞0.05)，G9-G10組與對照組C比差異顯著(P＜0.05)。ゼ尤肟嗖渭24h后，從成纖維細胞的MTT比色吸光值的結果得出，苦參堿對增生性瘢痕成纖維細胞作用的增殖抑制率：在0.25～100mg/ml范圍內(nèi)成劑量依賴性抑制作用。見附表。

附表Mat不同濃度組與細胞培養(yǎng)上清液LDH、細胞增殖抑制率的關系

2.2PCNA檢測結果顯示，對照組增生性瘢痕成纖維細胞的細胞核內(nèi)可見高密度棕黃色陽性信號，而經(jīng)苦參堿作用后，其成纖維細胞的細胞核內(nèi)可見淡黃色陰性信號，PCNA表達較弱，見圖1，2(見封三彩頁圖B1、2)。

3討論

3.1多年以來，醫(yī)學界一直在尋找治療瘢痕的有效途徑。苦參堿是具有生物調節(jié)作用的生物堿，化學結構式為四環(huán)喹嗪啶類稠合體，分子量為248.37，分子式為C15H24N₂O。為證實苦參堿對瘢痕的治療作用，本文通過體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞的MTT和LDH實驗，驗證苦參堿對增生性瘢痕成纖維細胞的增殖呈劑量依賴性抑制作用，隨著苦參堿濃度升高，細胞呈抑制狀態(tài)，在0.5mg/ml～5.0mg/ml細胞增殖抑制率約50%；通過細胞培養(yǎng)上清中的乳酸脫氫酶的檢測，證實苦參堿在0.10mg/ml～100mg/ml對增生性瘢痕成纖維細胞不產(chǎn)生毒性作用，當濃度超過150mg/ml～200mg/ml時對增生性瘢痕成纖維細胞有毒性作用，在200mg/ml濃度時可致發(fā)生細胞壞死性改變。

3.2在細胞周期中，一些蛋白質的合成對于細胞進入由G0/G1期進入S期是必不可少的，如，降鈣素、非組蛋白、染色體蛋白和PCNA等，PCNA又稱周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提純^〔4〕，PCNA單抗是針對增殖細胞核抗原(prolideration cell nuclear antigen)的抗體，其功能是DNA多聚酶δ的輔助因子，它的出現(xiàn)明顯與細胞增殖有關，在靜止期其量很少，G1晚期開始增加，S期達到高峰，G₂、M期明顯下降〔5，6〕。故PCNA是了解細胞增殖活性狀態(tài)的重要指標。本實驗結果表明經(jīng)苦參堿作用后PCNA的表達明顯減弱，說明苦參堿可抑制呈活性增殖狀態(tài)的瘢痕成纖維細胞，使其DNA的合成明顯減少，增殖受阻。ド鮮黿峁驗證苦參堿對瘢痕成纖維細胞的增殖活性有明顯的抑制作用，其抑制機制的研究有待于進一步深入，為利用中藥、開發(fā)治療增生性瘢痕的新途徑提供依據(jù)。

［參考文獻］

1Sherrell GA,Robert.WB,Char les.HM,et al. Grabb and Smiths Plastic Surgery［M］. Fifth Edition Litpincatp-Raver.New.York,1999:3～13

2湯蘇陽，蔡寶仁，黃高升.中醫(yī)藥治療瘢痕的研究進展［J］.中國美容醫(yī)學，2000；9(6)：469

3司徒鎮(zhèn)強，吳軍正，劉斌等.細胞培養(yǎng)［M］.北京：世界圖書出版社，第一版，1996：168～179

4Miyach K Frizier MJ TANEM.Autoantibodies to a nuclear antigen in proliferation cell［J］.J Immunol;1987;121(6):2228

5Prelich G,Tan CK,Kostura M.Blundell PA et al.Functional identity of proliferation cell nuclear antigen and a DNA polymerase-§ auxiliary protein［J］.Nature:1987:326(6113):517

6Rodrgo B,Heather MB.Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen duuing the cell cycle:Assiciation with DNA replication site［J］. Jcell Biol;1987;105(4):1549

收稿日期2000-10-24

編輯/樊延南