〔摘要〕 目的 本實(shí)驗(yàn)采用改良雙血管阻斷法建立大鼠血管性癡呆（VD）模型，比較不同提取工藝銀苓通脈健腦顆粒對(duì)VD模型大鼠的治療作用，篩選出更佳藥效作用的提取工藝路線，為新藥研發(fā)提供依據(jù)。方法 采用HPLC建立莫諾苷、馬錢苷含量測(cè)定方法，檢測(cè)樣品中莫諾苷、馬錢苷含量。采用大鼠雙側(cè)頸部血管結(jié)扎法（2-VO）建立VD模型，分別設(shè)置正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組、多奈哌齊組以及3個(gè)不同工藝樣品組。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組定位航行潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù);采用HE染色與尼氏染色觀察大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 莫諾苷、馬錢苷的回歸方程分別為Y=17.431X+5.369 4，r=1。Y=16.035X+9.730 4，r=0.999 9。分別在18.55～185.47 μg/mL、19.38～193.84 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。精密度、重復(fù)性、加樣回收率均較好（RSD均小于3%），陰性樣品無(wú)干擾，3個(gè)樣品莫諾苷、馬錢苷含量之和分別為：6.93、6.87、5.96 mg/g。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，工藝②、③號(hào)樣組大鼠定位航行第3、第4天潛伏期增加（P≤0.05），工藝②號(hào)樣能顯著增加大鼠穿越平臺(tái)次數(shù);HE染色結(jié)果顯示工藝②號(hào)樣組大鼠海馬組織部分海馬錐體細(xì)胞排列緊密;少量細(xì)胞間質(zhì)水腫;尼氏染色結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，工藝②號(hào)樣組大鼠海馬組織CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量明顯增加。結(jié)論 工藝②號(hào)樣的藥效最佳，為銀苓通脈健腦顆粒新藥研發(fā)的制備工藝提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 銀苓通脈健腦顆粒;提取工藝;血管性癡呆;莫諾苷;馬錢苷

〔中圖分類號(hào)〕R285.5""""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.005

〔收稿日期〕2024-07-08

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2024JJ7292）;湖南省科技廳科技創(chuàng)新引領(lǐng)計(jì)劃（2020SK2051）;湘衛(wèi)函〔2024〕43號(hào)（青年骨干人才）;湘中醫(yī)藥〔2024〕3號(hào)（骨干人才）。

〔通信作者〕*李躍輝，女，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：410256518@qq.com。

Effects of Yinling Tongmai Jiannao Granule prepared by different processes on spatial navigation ability in rat models of vascular dementia

LONG Jiawen1，2， HOU Fengfei3， ZENG Guirong4， DAI Xinwen3， ZHOU Rongrong2， XU Linben2， LI Yuehui1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China; 3. Hunan Butian Pharmaceutical Co.， LTD.， Huaihua， Hunan 418400， China; 4. Hunan Prima Pharmaceutical Research Center Co.， LTD.， Changsha， Hunan 410003， China

〔Abstract〕 Objective To compare the therapeutic effects of Yinling Tongmai Jiannao Granule prepared by different extraction processes on rat models of vascular dementia （VD） established by modified two-vessel occlusion method， and identify the optimal extraction process route with better pharmacological efficacy， so as to provide a basis for new drug development. Methods An HPLC method was established for the determination of morroniside and loganin content in the samples. The VD model was established using the two-vessel occlusion （2-VO） method in rats. Groups were set up including a normal control group， a sham-operated group， a model control group， a donepezil group， and three groups receiving different processing samples （sample 1 group， sample 2 group， and sample 3 group）. The Morris water maze test was employed to observe the latency to find the platform and the number of platform crossings in each group. Additionally， HE staining and Nissl staining were performed to observe the histopathological changes in hippocampal tissue of rats. Results The regression equations for morroniside and loganin were Y=17.431X+5.3694， r=1， and Y=16.035X+9.730 4， r=0.999 9， respectively， demonstrating good linearity within the ranges of 18.55-185.47 μg/ml and 19.38-193.84 μg/mL. The precision， repeatability， and recovery rates were good （RSDlt;3% for all）， with no interference from negative samples. The total content of morroniside and loganin in the three samples was 6.93 mg/g， 6.87 mg/g， and 5.96 mg/g， respectively. The results of Morris water maze test showed that compared with the model control group， the latency to locate the platform on the third and fourth days increased in rats of sample 2 and sample 3 groups （P≤0.05）， with sample 2 group showing a notable increase in the number of platform crossings. HE staining showed that some hippocampal pyramidal cells in the hippocampus of rats of sample 2 group were tightly arranged with slight interstitial edema. Nissl staining revealed a significant increase in the number of Nissl bodies in the CA1 region of the hippocampus in rats of sample 2 group compared with the model control group. Conclusion The processed sample 2 exhibited the best therapeutic effects， providing experimental data for the preparation process of Yinling Tongmai Jiannao Granule in new drug research and development.

〔Keywords〕 Yinling Tongmai Jiannao Granule; extraction process; vascular dementia; morroniside; loganin

本文引用： 龍伽雯， 侯鳳飛， 曾貴榮， 戴鑫汶， 周融融， 徐琳本， 李躍輝. 不同工藝的銀苓通脈健腦顆粒對(duì)大鼠血管性癡呆模型定位航行的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2025， 45（2）： 220-227.

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指各種類型的腦血管疾病及其相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素導(dǎo)致的且以癡呆為主要臨床表現(xiàn)的重度認(rèn)知障礙綜合征，被認(rèn)為是年齡相關(guān)性癡呆的第二種常見形式，在60歲以上人群中，VD患病率為1.26%～2.40%，占所有癡呆病因的12%～20%，癥狀主要是由腦血流不足導(dǎo)致的腦損傷引起[1-5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療VD備受關(guān)注，《中成藥治療血管性癡呆臨床應(yīng)用指南（2020年）》指出：“中成藥已成為我國(guó)治療血管性癡呆的選擇之一?！盵6]

銀苓通脈健腦是在公司獨(dú)家專利藥品“復(fù)方銀杏通脈口服液”處方基礎(chǔ)上進(jìn)行藥味加減，所組成新的處方，由酒山茱萸、銀杏葉、女貞子、丹參、姜黃、石菖莆、川芎、山臘梅葉、當(dāng)歸等12味中藥組成。全方諸藥相合，共奏補(bǔ)腎養(yǎng)肝、健腦益智、化瘀通脈之效，適用于VD肝腎虧虛、瘀血阻絡(luò)證者。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD發(fā)病部位在腦，且與心、肝、腎等臟器密切相關(guān)。腦為髓海，為腎精所化生，腎為先天之本，主藏精生髓，精氣充足則可髓足腦充，腦功能才得以正常運(yùn)作[7-8]。VD的核心病機(jī)是腎精不足、痰濁內(nèi)阻、瘀血阻滯，日久損髓傷腦，可通過(guò)補(bǔ)腎法改善腦血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)及修復(fù)神經(jīng)、抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來(lái)治療VD[9]。方中的君藥酒山茱萸作為山茱萸的炮制品，藥典規(guī)定含量測(cè)定的指標(biāo)成分為莫諾苷、馬錢苷，并有研究發(fā)現(xiàn)該兩種成分能改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和病理?yè)p傷，降低腦組織細(xì)胞凋亡率和自由基水平，抑制線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)[10]。處方中的莫諾苷和馬錢苷作為主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并作為指標(biāo)考察銀苓通脈健腦顆粒的提取工藝。

清代徐靈胎在《醫(yī)學(xué)源流論》中曰：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此?！敝兴帍?fù)方的療效與其提取方法密切相關(guān)，不同的提取工藝，其有效成分組成亦會(huì)不同，可能會(huì)呈現(xiàn)不一樣的藥效作用[11]。因此，為了篩選出更佳藥效作用的提取工藝，本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠雙側(cè)頸部血管結(jié)扎（two-vessel occlusion，2-VO）建立VD模型，研究不同提取工藝下銀苓通脈健腦顆粒對(duì)該模型的治療作用，為銀苓通脈健腦顆粒的制備工藝以及臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014;質(zhì)量合格證：430726221100014685，在湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司屏障環(huán)境D區(qū)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0015。

1.2" 試藥

異氟烷（批號(hào)：20201201，山東安特牧業(yè)科技有限公司產(chǎn)品）。注射用青霉素鈉（批號(hào)：F0042309，規(guī)格：160萬(wàn)U/瓶，性狀：白色粉劑，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品）。鹽酸多奈哌齊片（批號(hào)：20210204，浙江華海藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品）。莫諾苷對(duì)照品（批號(hào)：111998-202104，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供），馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)：111640-201804，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）。

1.3" 儀器

Morris水迷宮（成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品）;EG1150H+C型組織包埋機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)、DM2000型生物顯微鏡均購(gòu)自Leica公司;UltiMate 3000-DAD型高效液相色譜儀（賽默飛）;XPE105型電子分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法

2.1" 樣品制備

本品處方由酒山茱萸、銀杏葉、女貞子、丹參、姜黃、石菖莆、川芎、山臘梅葉、當(dāng)歸等12味組成，按5倍日用處方量稱取各飲片，按以下工藝制備樣品（各工藝處方藥味及劑量完全一致）。

工藝①號(hào)樣：酒山茱萸、銀杏葉等12味藥全部水煮兩次，第1次加適量水，煎煮2 h;第2次加適量水，煎煮1.5 h，合并煎煮液，濃縮至約1.2以上密度的稠膏。每1 g稠膏相當(dāng)于生藥1.9738 g。

工藝②號(hào)樣：處方12味藥，其中石菖蒲、姜黃、川芎加適量水，蒸餾提取揮發(fā)油5 h，收集油，β-CD包合，包合物碾細(xì)，備用;藥液濾過(guò)，濾液備用，藥渣再加適量水煮0.5 h，濾過(guò)，合并濾液備用;其余酒山茱萸肉、銀杏葉等9味加水煎煮兩次，第1次加適量水，煎煮2 h;第2次加適量水，煎煮1.5 h，濾過(guò)，濾液與提取揮發(fā)油后的濾液合并，濃縮至約1.2以上密度的稠膏，加入β-CD包合物。每1 g稠膏相當(dāng)于生藥2.0206 g。

工藝③號(hào)樣：處方12味藥，其中銀杏葉、女貞子、丹參、姜黃加70%乙醇提兩次，第1次加適量水，回流2 h;第2次加適量水，回流1.5 h，合并，回收乙醇，酒山茱萸等其余8味水煮兩次，第1次加適量水煎煮2 h，第2次加入醇提后藥渣，加適量水煎煮1次，濃縮，與醇浸膏合并，濃縮至約1.2以上密度的稠膏。每1 g稠膏相當(dāng)于生藥1.907 3 g。

2.2" 動(dòng)物分組及模型建立

選取檢疫合格的雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量220～250 g，隨機(jī)選取8只大鼠作為正常對(duì)照組，8只作為假手術(shù)組，其余大鼠采用改良2-VO法建立大鼠VD模型。具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，于近心端和遠(yuǎn)心端血管兩端結(jié)扎，從結(jié)扎中心剪斷頸總動(dòng)脈，分層縫合并以青霉素40萬(wàn)U/只肌內(nèi)注射預(yù)防感染，6 d后以同樣方法處理左側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎及剪斷頸總動(dòng)脈，其余操作步驟同手術(shù)造模。模型建立6周后選取存活的造模大鼠40只隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、多奈哌齊組（0.9 mg/kg）、工藝①號(hào)樣組（4.95 g生藥/kg）、工藝②號(hào)樣組（4.95 g生藥/kg）、工藝③號(hào)樣組（4.95 g生藥/kg），每組8只。正常對(duì)照組和假手術(shù)組分別灌胃給予純水，其余各組分別灌胃給予相應(yīng)藥液，給藥體積為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)給藥6周，大鼠全部存活，大鼠毛發(fā)及體重變化不顯著。

2.3" 水迷宮實(shí)驗(yàn)

末次給藥后各組大鼠分別進(jìn)行水迷宮檢測(cè)，首先進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，歷時(shí)4 d。將平臺(tái)固定于第2象限的中央，水池中注入自來(lái)水，倒入白色染料使平臺(tái)不可見，水位高于平臺(tái)1.0 cm。水溫穩(wěn)定在（25±1） ℃。每天每只動(dòng)物測(cè)試1次，測(cè)試前先將動(dòng)物放在平臺(tái)上適應(yīng)10 s，隨機(jī)選取3個(gè)入水點(diǎn)，檢測(cè)60 s，若成功找到平臺(tái)則讓其在平臺(tái)上停留10 s再歸籠，若未找到平臺(tái)則引導(dǎo)動(dòng)物至平臺(tái)，停留10 s。記錄動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期/總時(shí)間）、游泳總路程、平均速度等指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。第5天進(jìn)行空間探索，檢測(cè)動(dòng)物穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)。

2.4" HE染色和尼氏染色檢測(cè)

各組大鼠異氟烷麻醉，解剖取腦組織置于10%福爾馬林中固定，進(jìn)行HE染色和尼氏染色，觀察皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、排列、凋亡及微血管等形態(tài)學(xué)特征。

2.5" 含量測(cè)定方法建立

2.5.1" 色譜條件 " 色譜柱：Sepax Bio-C18（250 mm×

4.6 mm，5 μm）色譜柱;流動(dòng)相：乙腈-0.3%磷酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，7%乙腈;20～50 min，7%→20%乙腈）;檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL;柱溫：35 ℃。

2.5.2" 對(duì)照品溶液制備" 取莫諾苷對(duì)照品、馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL各含50 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.5.3" 供試品溶液制備" 取本品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5.4" 方法學(xué)考察" （1）專屬性實(shí)驗(yàn)：精密供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀中測(cè)定，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置無(wú)相應(yīng)的峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾。（2）精密度：取本品適量（批號(hào)：20220801），研細(xì)，取約1 g，精密稱定，同供試品溶液制備方法制備，精密吸取同一份供試品溶液10 μL，色譜條件下進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。（2）線性范圍：將對(duì)照品溶液分別稀釋到相應(yīng)的濃度，色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以各對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。（3）重復(fù)性：取同一批號(hào)樣品適量（批號(hào)：20220801），研細(xì)，取6份，每份取約1 g，精密稱定，同供試品溶液制備方法制備，色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量并計(jì)算RSD值。（4）穩(wěn)定性：取本品適量（批號(hào)：20220801），研細(xì)，取約1 g，精密稱定，同供試品溶液制備方法制備，分別于0、4、8、12、16、20、24、30、36、42、48 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。（5）加樣回收率：取同一批（已知莫諾苷、馬錢苷含量）樣品，共6份，每份約0.5 g，精密稱定，每份分別加入適量的莫諾苷、馬錢苷對(duì)照品，按供試品制備方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。（6）3批樣品含量測(cè)定：按照供試品溶液的制備方法處理，測(cè)定3批成品中莫諾苷、馬錢苷的含量。

2.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效數(shù)字修約按照四舍五入進(jìn)行，數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0。計(jì)量資料以“x±s”表示，用Leven's test方法檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以α=0.05為檢驗(yàn)界限，其中以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 不同提取工藝樣品莫諾苷、馬錢苷含量

為比較3種不同制備工藝中莫諾苷、馬錢苷的含量，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，按上述條件進(jìn)行方法學(xué)考察，其專屬性結(jié)果表明，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置無(wú)相應(yīng)的峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾。精密度結(jié)果表明，莫諾苷、馬錢苷的RSD值均小于3%，表明精密度良好。莫諾苷、馬錢苷的回歸方程分別為Y=17.431X+5.3694，r=1。Y=16.035X+9.730 4，r=0.999 9，結(jié)果表明莫諾苷、馬錢苷分別在18.55～185.47 μg/mL、19.38～193.84 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。重復(fù)性結(jié)果表明，6份樣品莫諾苷含量平均值為1.94 mg/g，馬錢苷含量平均值為1.16 mg/g，RSD為1.03%，說(shuō)明方法重復(fù)性較好。穩(wěn)定性結(jié)果表明，莫諾苷RSD為0.25%，馬錢苷RSD為0.18%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。加樣回收率結(jié)果表明，莫諾苷平均回收率為101.99%，RSD為2.9%;馬錢苷平均回收率為101%，RSD為1.69%，RSD均小于3%，說(shuō)明本方法加樣回收率較好，詳見圖1。含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示，工藝①、②號(hào)樣品較工藝③樣品較高。通過(guò)含量測(cè)定法測(cè)定3種不同提取工藝中莫諾苷、馬錢苷的含量，結(jié)果顯示①、②號(hào)樣品的提取工藝更優(yōu)，旨在說(shuō)明工藝不同的制備工藝對(duì)莫諾苷、馬錢苷的含量有差異。

3.2" 不同工藝的銀苓通脈健腦顆粒對(duì)大鼠VD模型定位航行的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠定位航行第1、第2天潛伏期無(wú)顯著差異，定位航行第3、第4天潛伏期增顯著加（Plt;0.01）;與模型對(duì)照組比較，工藝②、③號(hào)樣組大鼠定位航行第3、第4天潛伏期顯著減少（Plt;0.05），鹽酸多奈哌齊組大鼠定位航行第3、第4天潛伏期減少（Plt;0.01）。詳見圖3和表1。

3.3" 銀苓通脈健腦顆粒不同工藝對(duì)大鼠VD模型空間探索的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（Plt;0.01）。與模型對(duì)照組比較，工藝②號(hào)樣組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（Plt;0.01），鹽酸多奈哌齊組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（Plt;0.01）。詳見表2。

3.4" 銀苓通脈健腦顆粒不同工藝對(duì)大鼠皮質(zhì)和海馬組織病理學(xué)的影響

正常對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠海馬組織可見神經(jīng)元形態(tài)、膠質(zhì)細(xì)胞、海馬錐體細(xì)胞未見異常;模型對(duì)照組大鼠海馬組織可見部分錐體細(xì)胞排列稀疏紊亂、部分錐體細(xì)胞壞死、間質(zhì)水腫。工藝①、③號(hào)樣組大鼠海馬組織可見部分錐體細(xì)胞排列紊亂、間質(zhì)水腫;工藝②號(hào)樣組大鼠海馬組織部分海馬錐體細(xì)胞排列緊密;少量胞間質(zhì)水腫。鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織可見海馬錐體細(xì)胞排列緊密，少量胞間質(zhì)水腫。詳見圖4。

正常對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，神經(jīng)元胞內(nèi)尼氏體染色清晰，且數(shù)量較多。模型組小鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列疏松且部分神經(jīng)元胞內(nèi)尼氏體減少或消失。與模型對(duì)照組比較，工藝②號(hào)樣組大鼠海馬組織CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量明顯增加。詳見圖5。

4 討論

VD大鼠模型構(gòu)建多采用腦血管阻斷減少腦血流的方法制備動(dòng)物模型，其中永久性2-VO法是大鼠慢性低灌注引起VD可靠的動(dòng)物模型，是目前最為常用的制作大鼠慢性全腦缺血的經(jīng)典方法，并被廣泛應(yīng)用于VD研究中，其行為學(xué)特征主要表現(xiàn)出學(xué)習(xí)障礙和記憶損傷[12-16]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是邊緣系統(tǒng)內(nèi)的一個(gè)與情感、學(xué)習(xí)及記憶等高級(jí)認(rèn)知功能緊密相關(guān)的重要腦區(qū)，它參與情感和記憶，有研究表明，VD引起大鼠海馬神經(jīng)元損傷[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，VD大鼠模型大鼠海馬組織部分錐體細(xì)胞排列稀疏紊亂、部分錐體細(xì)胞壞死、間質(zhì)水腫，且尼氏小體數(shù)量明顯減少，工藝②能明顯增加大鼠海馬組織尼氏小體數(shù)量。綜上所述，工藝②號(hào)樣能明顯改善VD記憶損傷。

在中藥新藥工藝研究的過(guò)程中，提取路線的選擇是最為重要的環(huán)節(jié)之一，與治療效果密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，工藝②號(hào)樣能明顯改善VD記憶損傷，由于工藝②號(hào)樣在提取過(guò)程中是將含揮發(fā)油成分的石菖蒲、川芎、姜黃采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取，能夠高效提取揮發(fā)油成分，而工藝①號(hào)樣是將處方全部藥味按傳統(tǒng)水煎煮方式進(jìn)行提取，工藝③則是先將銀杏葉、丹參、姜黃加70%乙醇提取兩次，其余藥味煎煮，以上3種不同提取工藝對(duì)治療VD均有效果，但工藝②號(hào)樣較工藝③、④號(hào)樣改善VD記憶損傷更明顯，與其提取方式相關(guān)。現(xiàn)代亦有研究表明中藥揮發(fā)油成分對(duì)于認(rèn)知功能障礙具有一定的改善作用[19]。石菖蒲-川芎藥對(duì)及其有效組分可通過(guò)調(diào)節(jié)與VD相關(guān)的多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善VD、延緩其進(jìn)展，能通過(guò)大腦皮質(zhì)乙酰膽堿酯酶（acetylch?olinesterase，AChE）/乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）途徑、減輕過(guò)氧化損傷、調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)遞質(zhì)，及提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性來(lái)降低丙二醛（alondialdehyde，MDA）含量，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力、保護(hù)血管內(nèi)皮進(jìn)而改善VD[20-22]。山蠟梅葉揮發(fā)油可以升高血清中SOD活性，降低MDA含量，以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，保護(hù)大鼠腦海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞，從而改善大鼠的認(rèn)知功能障礙[23]。石菖蒲揮發(fā)油能顯著減少β-淀粉樣肽40（Aβ1-40）和GFAP在海馬中的含量，揮發(fā)油及水煎液均能降低大腦和海馬內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）活性，顯著改善β-淀粉樣肽42（Aβ1-42）致阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[24-25]。當(dāng)歸揮發(fā)油可縮短小鼠的逃避潛伏期，顯著增加穿越平臺(tái)次數(shù)，下調(diào)MAOA、DRD2蛋白表達(dá)，通過(guò)多巴胺能突觸、鈣離子信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多條信號(hào)通路來(lái)以有效改善VD小鼠的認(rèn)知功能[26]。趙秀茹等[27]發(fā)現(xiàn)莫諾苷能改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和病理?yè)p傷，抑制腦組織細(xì)胞凋亡和自由基水平，通過(guò)調(diào)控SOD、MDA和LDH血清水平，下調(diào)Bax/Bcl-2比率、cyto胞質(zhì)水平、裂解形式Caspase-9、Caspase-3及p53蛋白表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)VD大鼠的治療作用。本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了不同提取工藝下銀苓通脈健腦顆粒的藥效差異，證明了篩選的工藝能顯著減少大鼠定位航行第3、第4天潛伏期，增加大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)，改善癡呆大鼠海馬和皮質(zhì)組織病理變化，增加大鼠海馬、皮質(zhì)組織尼氏小體數(shù)量。本研究中，篩選的工藝為部分藥味采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，其余藥味水提，所得樣品中含有揮發(fā)油、較多的莫諾苷等水溶性成分，表明這些物質(zhì)可能跟銀苓通脈健腦顆粒改善VD記憶損傷等活性相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以模型定位航行潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及對(duì)大鼠皮質(zhì)和海馬組織病理學(xué)影響為考查指標(biāo)，并以莫諾苷和馬錢苷為含測(cè)指標(biāo)，比較水提、醇提、是否提揮發(fā)油的不同工藝對(duì)VD大鼠的影響，選擇合適的提取路線，有利于銀苓通脈健腦顆粒更好地發(fā)揮補(bǔ)腎養(yǎng)肝、健腦益智、化瘀通脈之功效，對(duì)其臨床上更好地發(fā)揮治療VD的藥效具有較大的參考意義，為該藥的新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（本文編輯" 蘇" 維）