摘要" 為探討不同溫度貯藏條件下普洱生茶中有效成分及理化特征變化情況，本試驗(yàn)采用高效液相色譜技術(shù)（HPLC），測定不同貯藏溫度（5、20和35"℃）條件下普洱生茶中沒食子酸（GA）、兒茶素（C）和表兒茶素（EC）等6種多酚類化合物和咖啡因的含量，并檢測茶湯色澤和pH變化。結(jié)果表明，該方法分離7種化合物分離度良好，質(zhì)量濃度范圍與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，加樣平均回收率99.45%～100.96%，RSD為0.08%～1.99%；溫度對茶湯顏色無明顯影響；pH呈現(xiàn)波動(dòng)變化，5和20"℃貯藏條件下的茶湯pH變化較平緩，35"℃變化較明顯；7種化合物含量變化均呈先下降后緩慢上升趨勢。綜上，HPLC測定方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可同時(shí)測定普洱生茶中GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因7種成分的含量，且貯藏在5～20"℃條件下更有利于茶湯pH及化合物含量的穩(wěn)定，本研究為普洱生茶貯藏的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞" 普洱生茶；多酚類化合物；咖啡因；貯藏溫度；高效液相色譜

中圖分類號" TS272.7；O657.7+2"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2025）01-0101-07

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.01.020

Analysis of active components and physicochemical characteristics of Pu-erh raw tea at different storage temperatures

Abstract" To investigate the changes in active components and physicochemical characteristics in Pu-erh raw tea under different temperature storage conditions， high-performance liquid chromatography （HPLC） technology was used to" determine the content of 6 polyphenolic compounds， including GA， C， and EC， sa well as caffeine in Pu-erh raw tea under different temperature storage conditions （5， 20， and 35"℃）， and to detect the changes in tea color and pH value. The results showed that the separation of 7 compounds by this method was good， and the mass concentration range showed a good linear relationship with its peak area. The relative standard deviation of precision， stability， and repeatability were all less than 5%， and the average recovery rate was 99.45% to 100.96% （RSD was 0.08% to 1.99%）; temperature storage conditions had no significant effect on the color of tea soup; the pH value shows fluctuating changes. The pH changes of tea soup under storage conditions of 5"and 20"℃ were relatively gentle， while the change was more significant at 35"℃; the content changes of the seven compounds showed a trend of first decreasing and then slowly increasing. In summary， HPLC method is simple， accurate， and has good reproducibility， and can simultaneously determine the content of GA， EC， EGCG， GCG， ECG， and caffeine components， and storing at 5-20"℃ is more conducive to the stability of tea pH and compound content， providing a reference for the quality control of Pu-erh raw tea storage.

Keywords" Pu-erh raw tea; polyphenolic compounds; caffeine; storage temperature; high performance liquid chromatography

普洱茶歷史悠久，是以云南大葉種曬青毛茶為原料加工而成的緊壓茶，分為熟茶和生茶，其中生茶以自然的方式陳化，不經(jīng)過人工發(fā)酵、堆制處理[1-2]。普洱茶原料源自云南的大葉種茶，生長在海拔1 200～1 400"m的亞熱帶和熱帶山地森林中，在保山、臨滄和普洱等地均有分布[3]。普洱生茶的主要化學(xué)成分包括多酚類化合物，有機(jī)酸及其衍生物，如沒食子酸（Gallic acid，GA）、咖啡酸、綠原酸、檸檬酸和蘋果酸等；氨基酸及其衍生物，如茶氨酸、亮氨酸等；生物堿及其衍生物，如咖啡堿、可可堿等。這些物質(zhì)為茶葉提供了鮮爽和苦澀的口感。茶多酚是普洱生茶中一類重要的化合物，是多種酚類衍生物的總稱，占茶葉干物質(zhì)總量的20%～30%，主要包括兒茶素類，如兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）等[4-6]。普洱生茶具有降脂、消炎、降血糖、降血壓以及保肝、抑制酒精性胃損傷等功效[7-9]。

普洱生茶在陳化過程中，茶多酚、氨基酸和糖類等主要化學(xué)成分發(fā)生變化，發(fā)酵形成獨(dú)特的品質(zhì)和香氣。溫度和濕度是影響普洱生茶品質(zhì)的重要因素，GB/T 331608—2023《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 茶葉》[10]對茶葉中的污染物和農(nóng)藥殘留做出了相關(guān)規(guī)定。鐘舒潔等[11]研究發(fā)現(xiàn)，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法受雜質(zhì)干擾較小，適用于檢測普洱茶中的黃曲霉菌含量；侯冬巖等[12]研究表明，采用高效液相色譜法測定生普洱茶和熟普洱茶樣品的咖啡因含量，其變異系數(shù)較小、回收效率較高。關(guān)于溫度對普洱生茶影響的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)將普洱生茶分別在5、20和35"℃條件下貯藏30"d，采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）測定其沒食子酸、表兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，ECG）和咖啡因的含量，觀察溫度對茶湯色澤和pH的影響，得出普洱生茶較適宜的貯藏溫度，為建立一種準(zhǔn)確靈敏、快速簡便測定普洱生茶中有效成分的方法提供參考。

１ 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

普洱生茶茶餅購自云南龍潤茶業(yè)集團(tuán)有限公司，原料為云南大葉種曬青毛茶，產(chǎn)地為云南保山，生產(chǎn)日期為2023年4月18日。試驗(yàn)開始前，茶葉按要求存放在干凈、通風(fēng)、避光、干燥且無異味的環(huán)境中。將茶餅分散并隨機(jī)分成3份，分別裝入1 000"mL棕色廣口瓶中，分別在5、20和35"℃條件下保存。

乙腈（色譜純）購自Sigma Aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（分析純）和磷酸（分析純）均購自天津大茂化學(xué)試劑廠。沒食子酸（批號：wkq16081904，純度≥98%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號：wp24010207，純度≥98%）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號：wkq23030804，純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司；表兒茶素（批號：N1106CS，純度≥98%）和表兒茶素沒食子酸酯（批號：J0106BS，純度≥98%）購自大連美侖生物科技有限公司；兒茶素（批號：P02A9F57645，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；咖啡因（批號：PS011597，純度≥98.5%）購自成都普思生物科技有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)儀器

HPLC采用Agilent 1200高效液相色譜儀，鍵合硅膠柱為Agilent Zorbax C18 （150 mm× 4.6"mm，5 μm）（美國Agilent公司）；T-10900型電子天平（上海普春計(jì)量儀器有限公司）；AB265-SMET-TLER TOLEDO 十萬分之一分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；pHS-25酸堿度測量儀（上海儀器儀表有限公司）；冰箱（合肥美菱股份有限公司）；303A-0S電熱恒溫箱（紹興上虞魯豐儀器制造有限公司）；303-0A恒溫培養(yǎng)箱（紹興一成儀器制造有限公司）；8002TDA溫度控制儀（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 樣品在Agilent Zorbax C18（150 mm× 4.6"mm，5 μm）上分離，流動(dòng)相由乙腈（溶劑A）和0.1%磷酸水（溶劑B）組成。流速0.8"mL/min，色譜柱溫度30"℃，紫外檢測器的檢測波長275"nm，進(jìn)樣量均為10 μL。梯度程序如表1所示。

1.3.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱量GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因，并將其溶解在甲醇中，分別配制成濃度為2.640、0.227、0.404、0.430、0.687、0.443和0.503"mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于5"℃條件下。分別稱取儲(chǔ)存在5、20和35"℃條件下的茶葉1"g，將其加入50"mL預(yù)熱至70"℃的70%甲醇中，混勻后靜置10"min，溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 線性關(guān)系檢驗(yàn) 分別吸取2、4、6、8、10和12 μL的GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。以進(jìn)樣量和峰面積繪制各成分的線性回歸方程。

1.3.4 精密度 精密吸取配制成1.3.2中各成分樣品溶液，在1.3.1色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性 分別于0、2、4、8、12和24"h精密吸取1.3.2中各成分樣品溶液，在1.3.1色譜條件下進(jìn)樣，測定其峰面積RSD。

1.3.6 重復(fù)性 取1.3.2中各成分樣品溶液，在1.3.1色譜條件進(jìn)行程序洗脫，測定其峰面積RSD。

1.3.7 加樣回收率 精確稱量樣品，加入已知量的各標(biāo)準(zhǔn)化合物，獲得回收率；然后按照相同方法處理和分析這些混合樣品，重復(fù)6次，計(jì)算平均回收率及回收率RSD。

1.3.8 化合物含量 每7 d取不同貯藏溫度條件下茶葉樣品，按1.3.2方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下進(jìn)樣，測定7種化合物含量。

1.3.9 顏色變化與pH 分別取3個(gè)貯藏溫度的茶葉0.5"g，將其加入預(yù)熱至100"℃的30"mL水中，混勻靜置10"min，測定pH；然后將溶液轉(zhuǎn)移到透明塑料離心管中，拍照記錄顏色變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將高效液相色譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 2022軟件并繪制成色譜圖，使用GraphPad Prism 9.5.0軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)檢驗(yàn)

2.1.1" 線性關(guān)系 以GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，線性回歸方程見表2。說明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度 GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面積RSD分別為0.08%、0.08%、0.11%、0.08%、0.09%、0.12%和0.13%，說明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性 24"h內(nèi)GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面積RSD分別為0.68%、0.23%、0.28%、0.18%、0.33%、0.19%和0.25%，表明樣品溶液在24"h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.4 重復(fù)性 GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的峰面積RSD分別為0.21%、0.16%、0.22%、0.23%、0.36%、0.21%和0.17%。結(jié)果表明，該制備方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5 加樣回收率 由表3可知，GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的回收率RSD分別為0.97%、0.09%、0.65%、0.69%、1.99%、0.83%和0.08%，回收率符合要求。綜上，HPLC方法符合測試結(jié)果要求。

2.2" 化合物含量HPLC測定

2.2.1" 樣品峰圖疊加""" 檢測的5次結(jié)果經(jīng)軟件處理后形成疊加圖，可以更直觀地顯示每種化合物含量的變化。如圖1所示，不同溫度貯藏條件和保留時(shí)間下的化合物含量存在差異，以3個(gè)貯藏溫度條件下的GA、咖啡因、EGCG和ECG差異較明顯。35"℃貯藏條件下HPLC峰面積變化最為明顯，其他2種貯藏溫度條件下峰面積變化較為平緩。GA、C和EC等7種成分HPLC峰面積均呈先下降后上升的趨勢，在第3周出現(xiàn)最低值。

2.2.2 化合物含量變化""" 由圖2可知，3個(gè)貯藏溫度條件下的各化合物含量變化趨勢基本一致，在處理0—2周時(shí)，3個(gè)溫度下GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因的含量均出現(xiàn)明顯下降，在第2周達(dá)到最低值，20"℃下GCG含量在第1周為最低值，之后呈緩慢上升趨勢。整體上看，隨著貯藏溫度的升高，化合物含量變化較明顯。

2.3 茶湯顏色變化分析

由圖3可知，3個(gè)貯藏溫度條件下的茶葉存放30"d后，制成的茶湯顏色差異較小，均呈黃綠色。說明貯藏溫度條件對茶湯顏色無明顯影響。

2.4 pH變化分析

由圖4可知，5和20"℃貯藏條件下的茶湯pH變化較小，其中5 ℃貯藏條件下的茶湯pH呈先下降后上升的趨勢，20 °C貯藏條件下的茶湯pH呈先下降后上升再下降的趨勢，35"°C貯藏條件下的茶湯pH變化較大，以第4周的pH較大。說明在5和25"℃貯藏條件下的茶湯pH變化較穩(wěn)定，其口感較為均一。

3 結(jié)論與討論

普洱生茶因其獨(dú)特的品質(zhì)特征，具備越陳越香的貯藏價(jià)值[13]。優(yōu)質(zhì)貯藏條件能夠改善普洱生茶的風(fēng)味品質(zhì)，關(guān)于普洱茶的研究主要集中在貯藏環(huán)境條件及貯藏過程中其品質(zhì)變化等方面[14-15]。本研究采用HPLC測定3個(gè)溫度貯藏條件下的普洱生茶中GA、C、EC等7種物質(zhì)含量，同時(shí)檢測其茶湯色澤、pH變化。結(jié)果表明，HPLC測定普洱生茶中化合物含量的方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高。王麗等[16]研究認(rèn)為，HPLC方法檢測普洱茶中黃酮類化合物含量相對偏差較小，準(zhǔn)確率較高，該方法的回收率及精密度均符合測定要求；徐丹萍等[17]研究表明，HPLC測定方法重復(fù)性和精密度較好，其測定普洱熟沱茶葉中咖啡因含量的結(jié)果較為穩(wěn)定、可靠，咖啡因峰面積與含量之間具有良好的線性關(guān)系，本試驗(yàn)結(jié)果與此基本一致。在不同的貯藏溫度下，普洱生茶中不同種類化合物的含量呈不規(guī)則波動(dòng)，35"℃貯藏條件下的普洱茶中化合物含量波動(dòng)較大，5和20"℃貯藏條件下的化合物含量變化相對穩(wěn)定，處理第1周的化合物含量降低的原因可能是外界環(huán)境的突然改變。不同貯藏溫度存放30"d對茶湯色澤無明顯影響，在35"℃貯藏條件下，普洱生茶的pH波動(dòng)較大，5和20"℃時(shí)pH相對穩(wěn)定。

綜上，本研究建立了一種通過HPLC測定普洱生茶中GA、C、EC、EGCG、GCG、ECG和咖啡因 7種物質(zhì)含量的方法，該方法分離7種化合物分離度良好，質(zhì)量濃度范圍與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率均滿足測定要求。普洱生茶中化合物含量會(huì)因貯藏溫度的不同而發(fā)生變化，較高溫度會(huì)導(dǎo)致其含量波動(dòng)性較大，因此陰涼的環(huán)境（5～20"℃）更有利于保持普洱生茶的品質(zhì)，需保持貯藏溫度恒定。本研究為普洱生茶的貯藏質(zhì)量控制提供參考。

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