關(guān)鍵詞：鼠李糖乳桿菌；戊糖片球菌；口乳桿菌；大腸桿菌；生物被膜形成

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌黏附于物體表面將自身包裹于分泌的大量多糖、蛋白質(zhì)和DNA等多聚物質(zhì)中而形成的復(fù)雜膜狀結(jié)構(gòu)，一旦形成就會賦予細(xì)菌極強(qiáng)的耐藥性。大腸桿菌可直接在機(jī)體組織及器官表面形成生物被膜，提高了其耐藥性和黏附性，甚至能逃避免疫淋巴系統(tǒng)的分辨和攻擊，是導(dǎo)致畜牧業(yè)中細(xì)菌性疾病最常見的病原菌，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中，致病性大腸桿菌以生物被膜形式感染尤為常見，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重導(dǎo)致抗生素的療效不斷下降，出現(xiàn)反復(fù)感染。

乳酸菌作為一類公認(rèn)安全的益生菌，是定植在動物消化道內(nèi)的主要共生菌之一，具有促進(jìn)動物生長、提高機(jī)體免疫力、抑制腸道有害菌生長等特性，目前已在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品保健和畜牧獸醫(yī)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來，乳酸菌對病原菌的抑制作用備受關(guān)注，其可以通過改善宿主腸道微生態(tài)平衡來增強(qiáng)腸道免疫力并提高健康水平，還能夠預(yù)防和治療腹瀉等多種疾病，已成為較為理想的臨床治療方案之一，篩選具有抑菌活性以及耐藥性等功效的菌株是當(dāng)前畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域研究的熱點。

前期研究發(fā)現(xiàn)，雞腸道乳酸菌是較理想的益生菌來源，能提高畜禽的生長性能，改善免疫功能和雞肉品質(zhì)．對多種致病菌和霉菌的生長具有明顯的抑制作用，而關(guān)于雞源腸道乳酸菌對大腸桿菌生物被膜生成抑制作用的研究較少。本研究在建立大腸桿菌生物被膜模型的基礎(chǔ)上，觀察鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌和口乳桿菌對大腸桿菌生物被膜生成的抑制效果，旨在為探索乳酸菌拮抗大腸桿菌感染機(jī)制提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus thamnosus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、口乳桿菌（Lactobacillus oris）、大腸桿菌（Escherichia coli）菌種由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)代謝病與中毒病實驗室保存。0.9%生理鹽水、草酸銨結(jié)晶紫染液、革蘭氏染色液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、乳酸桿菌固體培養(yǎng)基、乳酸桿菌液體培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)菌活化

吸取200uL大腸桿菌菌種加入LB液體培養(yǎng)基，吸取200uL戊糖片球菌、鼠李糖乳桿菌或口乳桿菌菌液分別加入乳酸桿菌液體培養(yǎng)基。37℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24h后，分別涂布到對應(yīng)固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。挑取單個菌落，接種至對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢，確定細(xì)菌染色特征是否與對應(yīng)菌種相符。

1.3細(xì)菌生長曲線的測定

按培養(yǎng)液量5%加入菌液至錐形瓶中，37℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)，每隔6h取培養(yǎng)液1mL，加入石英比色皿，用培養(yǎng)液為對照調(diào)零，用分光光度計測280nm的OD值，以時間為橫坐標(biāo)、OD280值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株生長曲線，確定生長平臺期。

1.4種子茵液濃度的測定

將種子菌液用滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋107～108倍，分別取100uL接種至呈液體的相應(yīng)固體培養(yǎng)基中，混勻冷卻至培養(yǎng)基呈固體，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～36h。菌落計數(shù)后，計算種子菌液細(xì)菌濃度。

1.5細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)

1.5.1置片法將蓋玻片置于5%蛋清生理鹽水中浸潤后，超凈臺中自然干燥，置于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入3mL液體培養(yǎng)基。大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，戊糖片球菌等用乳酸桿菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。每孔加入300uL種子菌液，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在6、12、24h用無菌PBS清洗2次，干燥后甲醇固定5min。用結(jié)晶紫染色液或革蘭氏染色液染色10min，沖洗干燥后，用95%乙醇脫色5min，干燥后封片，鏡檢觀察生物被膜生長情況。

1.5.2微板法在96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入200uL菌液（108 CFU/mL），37℃孵育12h。吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS緩慢清洗2次，用200uL甲醇固定5min。吸棄甲醇后風(fēng)干，加入200uL結(jié)晶紫染色10min，洗滌干燥后，用95%乙醇脫色5min，在酶標(biāo)儀590nm波長下測定吸光度值。每個菌種重復(fù)4孔，取平均值。未接種菌液微孔加人生理鹽水作為陰性對照。

1.6乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成試驗

1.6.1全菌液抑制試驗（置片法）應(yīng)用置片法在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)大腸桿菌12h至生物被膜生成，用無菌PBS洗滌2次，加入2.70mL液體培養(yǎng)液和0.30mL乳酸桿菌全菌液，分別在6、12h時各取出兩個玻片，固定、染色及鏡檢方法同1.5.1。

1.6.2全茵液和上清液抑制試驗（微板法）將3種乳酸菌全菌液分別3000r/min離心10min，獲得上清液。在96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入200uL大腸桿菌菌液（108 CFU/mL），37℃孵育12h。吸棄上清液后，加入200uL乳酸菌全菌液或上清液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在6h和12h時測定OD590值，其他處理及檢測方法同1.5.2。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，吸光度值結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用One-way ANOVA比較處理間相關(guān)指標(biāo)差異，采用最小顯著極差法（LSD）對差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，Plt;0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1菌種鑒定

如表1所示，大腸桿菌和3種乳酸菌培養(yǎng)后經(jīng)菌落形態(tài)觀察和菌體革蘭氏染色鏡檢分析，確定均符合相應(yīng)細(xì)菌特征，可用于后續(xù)試驗。

2.2細(xì)菌生長曲線的測定

如圖1所示，4種菌株0D280值均在0～24h內(nèi)變化顯著，在24～36h內(nèi)變化減緩，36～48h內(nèi)變化較小，初步說明大腸桿菌培養(yǎng)24h、3種乳酸菌培養(yǎng)24～36h可達(dá)到生長平臺期。

2.3細(xì)菌生物被膜形成能力檢測

2.3.1置片法如圖2所示，大腸桿菌培養(yǎng)12h時革蘭氏染色可見菌體密集分布（圖2A），結(jié)晶紫染色顯示生物被膜開始形成，培養(yǎng)物連接呈片狀分布（圖2B）；24h時革蘭氏染色可見生物被膜形成明顯（圖2C），結(jié)晶紫染色可見交織鏈接的生物被膜骨架（圖2D）。由此確定大腸桿菌生物被膜在培養(yǎng)12h時初步形成，24h時能形成明顯的生物被膜。

3種乳酸菌生物被膜生成染色特征如圖3所示。培養(yǎng)至36h時被膜形成不明顯，也未見明顯的交織鏈接的生物被膜骨架（圖3）。初步確定3種乳酸菌培養(yǎng)36h時生物被膜的生成情況與大腸桿菌不同。

2.3.2微板法如圖4所示，大腸桿菌和3種乳酸菌微板法靜置培養(yǎng)前12h 0D590值逐漸升高，24～36h變化不明顯。其中，大腸桿菌、戊糖片球菌與口乳桿菌在培養(yǎng)6～36h的OD590值變化較小，說明上述3種細(xì)菌培養(yǎng)36h內(nèi)生物被膜生成變化較?。菏罄钐侨闂U菌培養(yǎng)6～36h生物被膜的OD590值顯著高于其他3種細(xì)菌，說明其生物被膜生成厚度可能更高。

2.4乳酸菌對大腸桿菌生物被膜形成的抑制作用

2.4.1全菌液抑制作用置片法結(jié)果大腸桿菌生物被膜培養(yǎng)12h（圖2）加入乳酸菌全菌液作用6h和12h，結(jié)果（圖5）顯示，3種乳酸菌均能顯著抑制大腸桿菌生物被膜的生成。作用6h時，鼠李糖乳桿菌組與口乳桿菌組大腸桿菌生物被膜片狀較小，數(shù)量較少（圖5A1、C1），戊糖片球菌組大腸桿菌生物被膜呈較大較多的片狀（圖581）；作用12h時，鼠李糖乳桿菌組大腸桿菌生物被膜呈較小的片狀，數(shù)量較少（圖5A2），戊糖片球菌組和口乳桿菌組大腸桿菌生物被膜呈較大較多的片狀（圖582、C2）。3種乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成的效果排序為鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。

2.4.2全菌液和上清液抑制作用微板法結(jié)果如圖6所示，鼠李糖乳桿菌全菌液組作用6h時OD590值顯著高于大腸桿菌和其他兩種乳酸菌（Plt;0.05），作用12h鼠李糖乳桿菌組OD590值顯著高于大腸桿菌組和戊糖片球菌組（Plt;0.05）（圖6A）。乳酸菌上清液作用6h和12h時，大腸桿菌OD590值均顯著高于3種乳酸菌組（Plt;0.05），作用12 h時鼠李糖乳桿菌組OD590值顯著低于戊糖片球菌組（Plt;0.05）（圖6B）。3種乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成的效果表現(xiàn)為鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。

3討論與結(jié)論

多數(shù)細(xì)菌在自然界和人類生活中以生物被膜形式存在，并黏附在各類有機(jī)或無機(jī)物表面，生物被膜耐藥性極強(qiáng)，可以在宿主的免疫應(yīng)答和吞噬作用下保護(hù)細(xì)菌。致病性大腸桿菌是臨床上常見的多重耐藥細(xì)菌，耐藥率呈逐年上升的趨勢，對動物和人類的健康構(gòu)成重大威脅。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計，大約有65%的微生物感染和80%的慢性感染與生物被膜有關(guān)。因此，建立確實可行的細(xì)菌生物被膜模型是進(jìn)行下一步研究的基礎(chǔ)，而置片法和微孔板法是常用的生物被膜研究方法。結(jié)晶紫通過離子相互作用與DNA、蛋白質(zhì)和生物被膜多糖等細(xì)菌細(xì)胞成分結(jié)合。通過結(jié)晶紫與黏附在微孔板上的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合，用于研究體外生物被膜的形成，OD值是檢測生物被膜形成能力的指標(biāo)。置片法發(fā)現(xiàn)大腸桿菌可在培養(yǎng)12h時開始形成生物被膜，細(xì)菌開始聚集，結(jié)晶紫染色后發(fā)現(xiàn)生物被膜呈明顯的片狀或團(tuán)塊狀，24h時形成明顯的膜狀物，發(fā)現(xiàn)明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，特征符合大腸桿菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)；并且微孔板法顯示，大腸桿菌培養(yǎng)24h和36h時0D值變化較小，也說明此時大腸桿菌生物被膜已經(jīng)形成，可用于后續(xù)生物被膜抑制試驗。另外，本研究置片法結(jié)果表明，3種乳酸菌單獨培養(yǎng)24h僅見菌體密集，即使培養(yǎng)36h也未見明顯的交織鏈接的生物被膜骨架和膜狀結(jié)構(gòu)等典型的生物被膜結(jié)構(gòu)：而結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)過程中OD值升高明顯，戊糖片球菌與口乳桿菌在培養(yǎng)過程中變化不明顯：綜合置片法和微板法結(jié)果，說明3種乳酸菌在現(xiàn)有條件下培養(yǎng)36h內(nèi)生物被膜形成能力不同，鼠李糖乳桿菌生物被膜形成能力優(yōu)于戊糖片球菌與口乳桿菌。

乳酸菌在代謝過程中能產(chǎn)生多種有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，能抑制腐敗微生物和致病菌生長，有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，增強(qiáng)宿主腸道抵抗力，預(yù)防和治療腹瀉，消除過敏等多種生物學(xué)功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌等乳酸菌對大腸桿菌等病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，但抑制試驗多集中在抑菌濃度、抑菌圈大小、抑菌曲線等方面，可能涉及多種機(jī)制，如改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成以及抑制酶活性等，而乳酸菌與細(xì)菌生物被膜的相互作用仍需深入研究。本研究通過置片法和微板法探索了3種乳酸菌對大腸桿菌生物被膜形成的抑制作用，其中3種乳酸菌均為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，因此可利用置片法+革蘭氏染色法更好地顯示乳酸菌對生物被膜生成的抑制作用。本研究置片法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸菌全菌液均能顯著抑制大腸桿菌生物被膜的生成，其中鼠李糖乳桿菌的抑制效果優(yōu)于其他兩種乳酸菌：應(yīng)用微板法測定乳酸菌全菌液和上清液對大腸桿菌生物被膜生成的抑制作用取得了相似的結(jié)果。

本研究在建立大腸桿菌生物被膜模型的基礎(chǔ)上，通過置片法和微板法觀察測定了3種乳酸菌對大腸桿菌生物被膜生成的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）大腸桿菌在培養(yǎng)12h時生物被膜呈片狀，24 h時形成明顯的膜狀物和交織鏈接的生物被膜骨架，不同于3種乳酸菌形成的生物被膜；（2）3種乳酸菌均對大腸桿菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，且抑制效果鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。