樊琛　徐旺燁　李丹丹等

摘要：采用KOD酶和rTaq酶，分別通過套式PCR檢測(cè)10株大腸桿菌iss基因，以探討PCR檢測(cè)大腸桿菌iss基因的缺陷及改進(jìn)方法。結(jié)果表明，rTaq酶、KOD酶對(duì)大腸桿菌iss基因1次PCR檢出率分別為40%、70%，套式PCR檢出率分別為80%、100%；KOD酶1次PCR檢出率高于rTaq酶，但未達(dá)100%，采用KOD酶套式PCR可降低大腸桿菌iss基因的漏檢可能性。

關(guān)鍵詞：PCR檢測(cè)；iss基因；套式；檢出率；大腸桿菌

中圖分類號(hào)： S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0069-02

收稿日期：2014-11-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金（編號(hào)：31302128）。

作者簡(jiǎn)介：樊琛（1978—），女，山東聊城人，博士，副教授，主要從事病原體分子生物學(xué)、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是編碼大腸桿菌補(bǔ)體抗性的基因，大小為309 bp，在人源、禽源大腸桿菌中皆有發(fā)現(xiàn)。1979年，Binns等從人源大腸桿菌ColV、I-K94質(zhì)粒獲得iss基因表達(dá)，能顯著增強(qiáng)含此基因大腸桿菌對(duì)1日齡雛雞的毒力，還能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化菌的血清抗性[1-2]。目前，國(guó)外相關(guān)研究者大多將iss基因檢測(cè)作為大腸桿菌毒力檢測(cè)的參考指標(biāo)之一，以1次PCR檢測(cè)結(jié)果iss+或iss-來判定iss基因在大腸桿菌中的存在情況。大腸桿菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探針方法檢測(cè)，這2種方法檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)不符合性，即某菌株P(guān)CR檢測(cè)可能為iss+而探針檢測(cè)為iss-，或PCR檢測(cè)為iss-而探針檢測(cè)為iss+[3-5]。而在實(shí)際應(yīng)用中，多以PCR檢測(cè)結(jié)果判定iss在大腸桿菌中的存在情況。本試驗(yàn)探討PCR方法檢測(cè)大腸桿菌iss基因缺陷的原因和改進(jìn)方法，以提高PCR檢測(cè)大腸桿菌iss基因的準(zhǔn)確性。1材料與方法

1.1菌株及其來源

10株大腸桿菌，分別采自黑龍江省、山東省、貴州省、新疆維吾爾自治區(qū)、北京市等地的雞場(chǎng)。

1.2引物合成

1.3酶類及主要生化試劑

蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA連接酶、pMD19-T vector克隆載體及相關(guān)試劑，均購(gòu)自寶泰克生物工程公司；DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；所用試驗(yàn)試劑均為分析純。

1.4大腸桿菌DNA提取

將待測(cè)菌瓊脂板劃線分離，挑取平板上菌落直徑2 mm的單菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值為7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混勻；55 ℃溫育10 min，再于80 ℃溫育10 min，加80 μL滅菌三蒸水，-20 ℃保存。

1.5iss基因檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)體系

iss PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大腸桿菌DNA模板5 μL、滅菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大腸桿菌DNA模板 2 μL、滅菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。

1.6擴(kuò)增反應(yīng)程序

1.6.1rTaq酶PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序97 ℃預(yù)變性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重復(fù)2次。對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)未得到目的片段的菌株進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2KOD酶PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序97 ℃預(yù)變性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重復(fù)1次。對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)未得到目的片段的菌株進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。同時(shí)做空白對(duì)照。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2結(jié)果與分析

由表1可見，10株大腸桿菌都含有iss基因；rTaq酶1次PCR檢測(cè)4株菌株為陽(yáng)性，6株為陰性，檢測(cè)率為40%；套式PCR檢測(cè)出現(xiàn)特異條帶，2株菌株檢測(cè)為陰性，擴(kuò)增出的iss基因經(jīng)序列測(cè)定，其核苷酸序列符合已發(fā)表的iss基因核苷酸序列，rTaq酶套式PCR檢出率為80%；KOD酶1次PCR檢測(cè)7株菌株為陽(yáng)性，3株為陰性，檢出率為70%，但重復(fù)性上有差異，陰性、陽(yáng)性菌株有所不同，套式PCR檢測(cè)也出現(xiàn)特異條帶，10株大腸桿菌都含有iss基因，檢出率為100%，擴(kuò)增出的iss基因經(jīng)序列測(cè)定，其核苷酸序列與已發(fā)表的iss基因核苷酸序列也相符。

3結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，iss基因在致病性大腸桿菌中的存在率要高于非致病性大腸桿菌。Johnson等對(duì)20株禽大腸桿菌進(jìn)行iss基因擴(kuò)增及致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明，6株致病性菌株為iss基因擴(kuò)增陽(yáng)性，14株非致病性菌株中有11株未擴(kuò)增出iss基因、3株擴(kuò)增出iss基因[7]。關(guān)于iss基因的定位，近來普遍認(rèn)為iss基因是定位在ColV質(zhì)粒上。有研究表明，在產(chǎn)生大腸菌素V（colicin V）的菌株中，人血液中有95.5%的菌株攜帶iss基因，腸道中有68.8%的菌株攜帶iss基因；禽源大腸桿菌iss基因與ColV同時(shí)出現(xiàn)的概率很高，iss基因很可能與ColV質(zhì)粒連在一起[8-9]。大腸桿菌ColV質(zhì)粒是低拷貝的大質(zhì)粒[10-11]。本試驗(yàn)PCR所用模板為菌體經(jīng)蛋白酶K消化后的粗提物，菌體消化程度可能影響PCR擴(kuò)增效率，采用常規(guī)質(zhì)粒提取及大質(zhì)粒提取方法均未獲得ColV質(zhì)粒。另外，由于ColV質(zhì)粒在各菌株中的拷貝數(shù)可能有所差異，也會(huì)導(dǎo)致ColV質(zhì)粒極低拷貝的菌株在1次PCR時(shí)未能擴(kuò)增出目的條帶。

試驗(yàn)結(jié)果表明，rTaq酶與KOD酶1次PCR時(shí)，iss基因的檢出率分別為40%、70%，套式PCR檢出率分別為80%、100%，KOD酶檢測(cè)大腸桿菌iss基因的檢出率均高于rTaq酶，KOD酶對(duì)大腸桿菌iss基因擴(kuò)增效率優(yōu)于rTaq酶。在重復(fù)性方面，KOD酶1次PCR檢測(cè)10株菌株中有2株菌株出現(xiàn)差異，可能與模板制備中菌體消化裂解程度及操作誤差有關(guān)；KOD酶套式PCR結(jié)果無差異，采用KOD酶套式PCR檢測(cè)能降低大腸桿菌iss基因的漏檢率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tivendale K A，Noormohammadi A H，Allen J L，et al. The conserved portion of the putative virulence region contributes to virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J]. Microbiology，2009，155（2）： 450-460.

[2]Ozawa M，Harada K，Kojima A，et al. Antimicrobial susceptibilities，serogroups，and molecular characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolates in Japan[J]. Avian Diseases，2008，52（3）： 392-397.

[3]Skyberg J A，Johnson T J，Johnson J R，et al. Acquisition of avian pathogenic Escherichia coli plasmids by a commensal E. coli isolate enhances its abilities to kill chicken embryos，grow in human urine，and colonize the murine kidney[J]. Infection and Immunity，2006，74（11）： 6287-6292.

[4]樊琛，王亞君，李一經(jīng). iss基因與雞大腸桿菌毒力相關(guān)性的分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（1）：58-61.

[5]Johnson T J，Wannemuehler Y，Doetkott C，et al. Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool[J]. Journal of Clinical Microbiology，2008，46（12）： 3987-3996.

[6]樊琛，程霜，劉桂芹，等. 雞大腸桿菌iss毒力基因研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（8）：53-54，128.

[7]Johnson T J，Wannemuehler Y M，Nolan L K. Evolution of the iss gene in Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）： 2360-2369.

[8]Oguttu J W，Veary C M，Picard J A. Antimicrobial drug resistance of Escherichia coli isolated from poultry abattoir workers at risk and broilers on antimicrobials[J]. Journal of the South African Veterinary Association，2008，79（4）： 161-166.

[9]Chuba P J，Leon M A，Banerjee A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J]. Molecular & General Genetics，1989，216（2/3）：287-292.

[10]Johnson T J，Giddings C W，Horne S M，et al. Location of increased serum survival gene and selected virulence traits on a conjugative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J]. Avian Diseases，2002，46（2）：342-352.

[11]Lefebvre B，Gattuso M，Moisan H，et al. Genotype comparison of sorbitol-negative Escherichia coli isolates from healthy broiler chickens from different commercial farms[J]. Poultry Science，2009，88（7）：1474-1484.何靜茹，李振堅(jiān). 外源激素對(duì)美花石斛試管內(nèi)花芽分化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11

：71-73.