王瑋 王景松 郭亞男 高樂 王玲玲 陳燦 王健霖 王建東 馬科 李繼東

摘 要：旨在調(diào)查寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）流行情況及毒力因子流行特點(diǎn)。對(duì)寧夏地區(qū)共采集332份腹瀉犢牛直腸糞便進(jìn)行病原分離，利用PCR方法對(duì)156株大腸桿菌分離株進(jìn)行13種相關(guān)毒力基因檢測。結(jié)果共分離出156株大腸桿菌（46.99%），共檢出136株含有毒力因子的大腸桿菌，表明目前寧夏地區(qū)腹瀉犢牛大腸桿菌陽性率較高，毒力因子組合復(fù)雜，優(yōu)勢毒力因子為irp2。

關(guān)鍵詞：犢牛；腹瀉性；大腸桿菌；毒力因子

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3261-06

收稿日期：2023-08-30

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022BBF03024）

作者簡介：王 瑋（1999-），女，河南南陽人，碩士生，主要從事動(dòng)物疾病診斷與防控技術(shù)研究，E-mail：wei_wang2022@163.com

*通信作者：李繼東，主要從事動(dòng)物傳染病的診斷與防治研究，E-mail：lijidongi@foxmail.com；郭亞男，主要從事獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)研究，E-mail：gyn330@126.com

Toxicity Factor Detection and Analysis of Escherichia coli Isolated Strains from

Calf Diarrhea Samples in Some Areas of Ningxia

WANGWei^1，2，WANGJingsong^1，2，GUOYa’nan^1*，GAOLe²，WANGLingling²，

CHENCan²，WANGJianlin²，WANGJiandong¹，MAKe³，LIJidong^2*

（1.Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry，

Yinchuan750002，China; 2.School of Animal Science and Technology，Ningxia University，

Yinchuan750021，China; 3.Ningxia Tongxin County Science and

Technology Service Center，Tongxin751300，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the prevalence and virulence factors of Escherichia coli（E.coli）in calves in Ningxia region.A total of332samples of diarrhea calf rectal feces were collected in Ningxia region for pathogen isolation，and156strains of E.coli were detected for13related virulence genes using PCR method.The results show that atotal of156strains（46.99%）of E.coli were isolated，and atotal of136strains containing virulence factors were detected.This indicates that the current positive rate of E.coli in diarrhea calves in Ningxia is relatively high，and the combination of virulence factors is complex，with irp2being the dominant virulence factor.

Key words：calves; diarrhea; Escherichia coli; toxicity factor

*Corresponding authors：LI Jidong，E-mail：lijidongi@foxmail.com; GUO Ya’nan，E-mail：gyn330@126.com

在國內(nèi)，引起犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌被廣泛研究，然而，近幾年的研究僅限于少數(shù)畜群，集中在病原的流行病學(xué)調(diào)查、血清型鑒定、耐藥性分析等研究^[1-3]。國內(nèi)外對(duì)于牛源性大腸桿菌毒力因子的研究僅限于單一毒力因子或者一類毒力因子的研究^[3-9]。目前，尚未見對(duì)寧夏地區(qū)犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子的系統(tǒng)性調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2022—2023年，對(duì)寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區(qū)、紅寺堡區(qū)、同心縣地區(qū)出現(xiàn)腹瀉的20個(gè)規(guī)?；瘓龊?3個(gè)散養(yǎng)戶，用無菌棉拭子采集3月齡左右犢牛直腸糞便，將單個(gè)肛拭子置于15mL無菌離心管中，并記錄采樣犢牛數(shù)量和其腹瀉情況等信息。參考菌株大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑

50×TAE緩沖液（20220110），購自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Y1127）購自天根生化科技（北京）有限公司；DL1000DNA Marker（AM51180A）、DL2000DNA Marker（AM31176A）購自TaKaRa公司；豆粉瓊脂（10803）購自青島日水生物技術(shù)有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（20230417）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）（20210311）購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血（HQ60071）購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

將采集單個(gè)直腸肛拭子（n=332）接種于5mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12h。然后用接種環(huán)按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24h。挑取典型單個(gè)菌落接種于5mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12h，劃線接種到無菌脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察菌株情況，同時(shí)接種到NB液體培養(yǎng)基中備用。通過對(duì)寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區(qū)、紅寺堡區(qū)、同心縣地區(qū)的腹瀉樣本，進(jìn)行大腸桿菌病原分離；分離菌DNA的提?。?6S rRNA PCR擴(kuò)增與序列測定；大腸桿菌毒素的檢測：采用PCR方法對(duì)K88、K99、987P、fedA、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、LT1、VT1、VT2all、SLT2毒素進(jìn)行特異性檢測^[10]。引物見表1，PCR體系為50μL：25μL2×Premix Taq，2μL10μmol·L^-1上、下引物，4μL細(xì)菌DNA模板，17μL超純水。PCR程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火（H88、F41、K99、987P、fedA、LT1、ST1、ST2、Stxl、VT2all56℃，F(xiàn)1860℃，LEE、HPI58℃）30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min；4℃保存。

2 結(jié) 果

糞便樣品經(jīng)分離培養(yǎng)基后結(jié)果顯示，從332份腹瀉糞便樣本中分離出156株大腸桿菌。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長出金屬光澤的黑色單一菌落；血平板上有中等大小、具有溶血圓的灰色圓形單一菌落。16S rRNA擴(kuò)增檢測到約1500bp目標(biāo)片段，與預(yù)期相符。

對(duì)不同地區(qū)、不同規(guī)模飼養(yǎng)場樣品的分離情況分析結(jié)果見表2。分離情況分析結(jié)果顯示，寧夏西吉縣、青銅峽、紅寺堡、同心縣，大腸桿菌檢出率分別為47.83%（22/46）、46.03%（58/126）、52.78%（38/72）、48.39%（30/62），利通區(qū)為30.77%（8/26）明顯低于其他地區(qū)；采集樣本犢牛腹瀉率紅寺堡為最高（50.00%），利通區(qū)腹瀉率為最低（26.92%）。

不同地區(qū)散養(yǎng)戶中大腸桿菌總檢出率為57.14%（32/56），規(guī)模場中大腸桿菌總檢出率為44.93%（124/276）。表明散養(yǎng)戶中更易存在大腸桿菌，這可能與散養(yǎng)戶飼養(yǎng)環(huán)境較差有關(guān)。

通過對(duì)156株腹瀉源性大腸桿菌菌株K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出大小約為841、543、280、425、183、360、664、484、281bp的片段（結(jié)果未展示），與預(yù)期結(jié)果一致。由表3可知，毒力基因K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2的檢出率分別為19.23%、3.85%、52.56%、25.64%、3.85%、1.28%、24.36%、21.79%、12.82%。未擴(kuò)增出987P、fedA、LT1、VT1的預(yù)期片段，這表明合成的引物可以用于K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2毒素特異性檢測。

對(duì)各菌株毒力基因組合分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示，未檢出毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有一個(gè)毒力因子的菌株有80株（51.28%），含有兩個(gè)毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有三個(gè)毒力因子的菌株有22株（14.10%），含有三個(gè)以上的毒力因子的菌株有14株（8.97%），在組合類別中，含有一個(gè)毒力因子的菌株所占的比例最高，為51.28%。

3 討 論

盡管腹瀉源性大腸桿菌通常集中于某些特定的血清型，但大腸桿菌的致病性并不完全與血清型有關(guān)，而主要是取決于其特定的毒力因子，如毒素、菌毛以及毒力島等?？刂七@些毒力因子的基因位于染色體上某些特殊的位點(diǎn)或染色體以外的基因（如質(zhì)粒）。傳統(tǒng)的檢測方法是直接處理病料，分離鑒定病原，檢測毒力因子，其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率低，特異性差，PCR方法用于大腸桿菌毒力因子的檢測具有敏感、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌致病性與其所攜帶的毒力基因密切相關(guān)，本研究對(duì)犢牛腹瀉大腸桿菌的毒力因子進(jìn)行檢測，在156株大腸桿菌分離株中，菌毛基因K88檢出率為19.23%，在37℃時(shí)表達(dá)良好，能凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞。腸毒素VT1（stx1特異性片段）、VT2all（stx2/stx2e特異性片段）、SLT2（stx2特異性片段）檢出率偏高，含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌屬于EHEC，在本次分離的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)是50株（32.05%），含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌人感染的重要病原體，部分是由于細(xì)菌與宿主細(xì)胞的緊密附著，由緊密蛋白介導(dǎo)，所述的緊密蛋白由eae基因以及至少一種志賀毒素基因（stx1/stx2）編碼，兩種毒素導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，且攜帶毒素?cái)?shù)量與菌株的毒力呈正比，stx1檢出率均高于stx2。

HPI毒力島、LEE毒力島檢出率較高，毒力島并不是先天的，是后天在進(jìn)化過程中獲得的，并且可以在不同菌株之間水平傳播，HPI（irp2）作為鐵調(diào)節(jié)基因，僅存在于強(qiáng)致病株中，與毒力密切相關(guān)，是判斷和檢測其它病源菌是否存在HPI（irp2）的標(biāo)志基因。本研究中毒力基因irp2的檢出率為52.56%。本試驗(yàn)中LEE（eae）檢出率為25.64%，與國內(nèi)外報(bào)道的檢出率相似^[12]。VT1、VT2all、SLT2檢出率分別為24.36%、21.79%、12.82%，高于國內(nèi)外報(bào)道的檢出率^[13-14]。

本試驗(yàn)中共檢測出26種陽性毒力譜，高于國內(nèi)外報(bào)道的檢出率^[13-14]。毒力因子組合復(fù)雜，各個(gè)組合檢出率較低，要研究犢牛的毒力譜與腹瀉率的關(guān)系需要進(jìn)行更深入的探索。由于K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2檢測率較高，針對(duì)五種毒力因子對(duì)犢牛進(jìn)行大腸桿菌病針對(duì)性治療，并對(duì)發(fā)生該病的牛場和養(yǎng)殖戶采取積極的防制措施。上述檢測出的毒力因子與EHEC菌株高檢出率提示應(yīng)重視牛源大腸桿菌的監(jiān)測及其對(duì)公共衛(wèi)生的威脅。并且認(rèn)為寧夏地區(qū)牛場存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要加強(qiáng)管理。菌株間毒力基因的差異是導(dǎo)致大腸桿菌致病力差異的重要原因，有必要對(duì)毒力因子進(jìn)行定期檢測，以便有效地防治大腸桿菌引起的犢牛腹瀉，為其防治提供參考依據(jù)。本試驗(yàn)對(duì)寧夏地區(qū)犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子組合類型研究進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)查，對(duì)該疾病的診斷和有效預(yù)防提供一定的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過對(duì)寧夏部分地區(qū)犢牛源腹瀉源性大腸桿菌進(jìn)行細(xì)菌病原分離、16S rRNA PCR和相關(guān)毒力因子PCR的分子生物學(xué)試驗(yàn)等一系列研究方法，表明大腸桿菌在寧夏部分地區(qū)發(fā)生腹瀉牛群中具有很高的流行率，分離株毒力因子組合復(fù)雜。K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2是從腹瀉犢牛分離的大腸桿菌中檢出率較高的毒力因子，發(fā)現(xiàn)26種不同的毒力譜，毒力基因種類多樣。有必要對(duì)犢牛源腹瀉性大腸桿菌的流行情況進(jìn)行持續(xù)的調(diào)查研究，為犢牛源大腸桿菌病的防治提供依據(jù)和參考。

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（編輯 白永平）