摘 要：本研究旨在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs）分化為胰島素分泌細(xì)胞（insulin producing cells，IPCs），通過干細(xì)胞療法達(dá)到臨床治療糖尿病的目的。本試驗(yàn)首先驗(yàn)證了Hnf1b基因在體外誘導(dǎo)犬AMSCs向IPCs分化中的作用，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合胰島細(xì)胞發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的級(jí)聯(lián)調(diào)控因子Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1，組成三種不同的多基因共表達(dá)腺病毒感染犬AMSCs，重編程其向IPCs分化，通過檢測(cè)篩選出最佳誘導(dǎo)組合。結(jié)果表明，Hnf1b基因?qū)w外誘導(dǎo)犬AMSCs向IPCs分化具有促進(jìn)作用。pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3（A）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4（B）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1（C）三種組合的多基因共表達(dá)腺病毒載體，在感染犬AMSCs25d后，A、B、C三組均形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，且B組數(shù)量最多，雙硫腙染色著色最深；高糖刺激下B組的胰島素分泌量極顯著高于A組和C組。A、B、C三組的胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量顯著升高；B組Pdx1基因的表達(dá)量顯著高于A組和C組，Pcsk1基因表達(dá)量極顯著高于C組；Ins基因的表達(dá)量顯著高于A組。綜上所述，Hnf1b基因?qū)w外誘導(dǎo)犬AMSCs向IPCs分化具有促進(jìn)作用，Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4基因聯(lián)合誘導(dǎo)效率最佳。該研究結(jié)果為探究干細(xì)胞向IPCs分化的更高效方法提供新參考，也為糖尿病的臨床治療提供新思路。

關(guān)鍵詞：糖尿?。蝗鹃g充質(zhì)干細(xì)胞；胰島素分泌細(xì)胞；Hnf1b基因；多基因共表達(dá)

中圖分類號(hào)：S856.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3205-08

收稿日期：2023-09-19

基金項(xiàng)目：2023年動(dòng)物防疫專項(xiàng)-低免疫原性新生胰（K3031223086）；金福萊恩防治跳蚤、蜱感染的臨床驗(yàn)證試驗(yàn)項(xiàng)目（K4020121004）

作者簡(jiǎn)介：朱明德（1998-），河南靈寶人，碩士生，主要從事動(dòng)物干細(xì)胞與組織工程研究，E-mail：15138191517@163.com

*通信作者：張欣珂，主要從事動(dòng)物干細(xì)胞與組織工程研究，E-mail：zxk2013@nwsuaf.edu.cn

Study on the Hnf1b，Pdx1，Ngn3and Pax4/Nkx6.1Reprograms

Canine Adipose-derived MSCs to Differentiate into IPCs

ZHUMingde，CHENYijing，DAIPengxiu，ZHANGYihua，ZHANGXinke^*

（College of Veterinary Medicine，Northwest Agricultural and Forestry University，

Yangling712100，China）

Abstract：The purpose of this study is to use transgenic technology to induce Adipose-derived mesenchymal stem cells（AMSCs）to differentiate into insulin secured cells（IPCs），and to achieve the purpose of clinical treatment of diabetes through stem cell therapy.This study first verified the role of Hnf1b gene in inducing the differentiation of canine AMSCs into IPCs in vitro，and on this basis combined with the cascade regulatory factors Pdx1，Ngn3，Pax4and Nkx6.1，which play akey role in the development of islet cells，three different polygenic co-expressing adenovirus infected canine AMSCs.It was reprogrammed to differentiate into IPCs，and the optimal induction combination was selected by detection.The results showed that Hnf1b gene could promote the differentiation of canine AMSCs into IPCs in vitro.Three combinations of multi-gene co-expression vectors were constructed，pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3（A），pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4（B），pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1（C）.After25days infected with canine AMSCs，pancreatic islet-like cell clusters were formed in group A，B，and C.Group Bhad the largest number，and dithizone staining was the deepest.The amount of insulin secretion in group Bunder high glucose stimulation was significantly higher than group Aand group C.The expressions of genes related to islet cell development in groups A，B and Cwere significantly increased.The expression of Pdx1gene in group Bwas significantly higher than group Aand group C; The Pcsk1gene expression in group Bwas significantly higher than that in group C; The expression of Ins gene in group Bwas higher than that in group A.In summary，Hnf1b gene can promote the differentiation of canine AMSCs into IPCs in vitro.It is shown that the combination of Hnf1b，Pdx1，Ngn3and Pax4genes has the best induction efficiency，which provides anew reference for exploring more efficient methods of stem cell differentiation into IPCs，and provides new ideas for clinical treatment of diabetes.

Key words：diabetes; canine adipose-derived mesenchymal stem cells; insulin producing cells; Hnf1b gene; multigene co-expression

*Corresponding author：ZHANG Xinke，E-mail：zxk2013@nwsuaf.edu.cn

Ⅰ型糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種自身免疫性疾病，它是由人體的免疫細(xì)胞攻擊并破壞胰腺中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌不足引起的^[1]。針對(duì)這種情況，進(jìn)行胰島移植，恢復(fù)內(nèi)源性胰島素分泌成為治療Ⅰ型糖尿病較為理想的方式。但由于胰島供體來源有限，分離純化過程繁瑣以及移植后的免疫排斥反應(yīng)，極大地限制其臨床應(yīng)用。因此，尋找胰島替代細(xì)胞移植治療Ⅰ型糖尿病成為目前研究的熱點(diǎn)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs）因其自身的諸多優(yōu)點(diǎn)，如不涉及倫理問題、易分離培養(yǎng)、增殖分化能力強(qiáng)以及移植后具有低免疫原性和免疫抑制特性等^[2-4]，使其成為胰島替代細(xì)胞移植的種子細(xì)胞之一。通過模擬胰島β細(xì)胞發(fā)育環(huán)境，改變培養(yǎng)基成分可將AMSCs體外誘導(dǎo)成胰島素分泌細(xì)胞（insulin producing cells，IPCs），但該誘導(dǎo)過程復(fù)雜、成本高、易損傷細(xì)胞，同時(shí)需要多種細(xì)胞因子、小分子化合物和信號(hào)通路激活/抑制劑共同配合，且誘導(dǎo)分化效率不理想。因此，尋求更加簡(jiǎn)便、高效的方法以獲得高成熟度的IPCs是一個(gè)亟待解決的問題。

胰腺發(fā)育過程受到多種信號(hào)途徑、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的共同調(diào)節(jié)。其中，胰肝細(xì)胞核因子1-β（Hnf1b）、胰腺十二指腸同源盒基因1（Pdx1）、神經(jīng)元素3（Ngn3）、NK轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)同源盒基因家族6基因座位1（Nkx6.1）、配對(duì)盒同源基因4（Pax4）在胰腺發(fā)育以及胰島素分泌過程中發(fā)揮著重要的作用^[5-9]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)胰島發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行激活或沉默操作，以此來誘導(dǎo)胰島替代細(xì)胞向IPCs分化，為體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向IPCs分化提供了更高效方法^[10]，也為基于干細(xì)胞的Ⅰ型糖尿病療法找到了突破口。Piran等^[11]從糖尿病患者體內(nèi)分離脂肪組織獲得AMSCs，然后將含有miR-375的慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的胰島素，Pdx1基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增加；Teshima等^[12]將犬AMSCs和人重組肽μ生物碎片組成的類球狀小簇在3D培養(yǎng)系統(tǒng)下成功分化為IPCs，用雙硫腙和抗胰島素抗體對(duì)生成的IPCs進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，犬IPCs顯示出胰腺β細(xì)胞特有的基因表達(dá)，并增加了胰島素分泌量。組織學(xué)檢查結(jié)果表明，IPCs小簇已成功被移植到小鼠體內(nèi)，并通過免疫熒光檢測(cè)出了對(duì)胰島素呈陽性的細(xì)胞。

本研究選擇犬AMSCs作為種子細(xì)胞，通過Hnf1b在犬AMSCs中的過表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證，來探究Hnf1b對(duì)犬AMSCs向IPCs分化過程的影響。在此基礎(chǔ)上，將Hnf1b與Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1以不同的組合方式構(gòu)建三種多基因腺病毒表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至犬AMSCs中，通過相關(guān)檢測(cè)篩選出誘導(dǎo)效果最佳的組合方式，為探究更高效的誘導(dǎo)方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

293A細(xì)胞、犬AMSCs、犬胰島細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)外科實(shí)驗(yàn)室保存。LB固體培養(yǎng)基干粉、Hanks液、雙硫腙染液購自北京索萊寶科技有限公司。2×SYBR Green Mix、EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技公司。免疫熒光一抗、二抗、Hoechst33342染液購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。TRIzol^?Reagent購自北京沃凱生物科技有限公司。Anti-Pdx1、Anti-Ngn3、Anti-Pax4、Anti-Hnf1b、Anti-Nkx6.1購自英國(guó)Abcam公司。

1.2 Hnf1b基因過表達(dá)時(shí)對(duì)犬AMSCs向IPCs體外誘導(dǎo)分化過程的影響

犬AMSCs經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，將第三代犬AMSCs接種于6孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)，加入重組腺病毒進(jìn)行感染，同時(shí)體外誘導(dǎo)犬AMSCs向IPCs分化，隔天換液，持續(xù)誘導(dǎo)25d后，棄去培養(yǎng)液，加入Hank’s液輕柔洗滌，加入DTZ放培養(yǎng)箱30min進(jìn)行雙硫腙染色觀察；同時(shí)設(shè)置單純誘導(dǎo)組和Hnf1b+誘導(dǎo)程序組兩個(gè)組別進(jìn)行糖刺激試驗(yàn)。每組分別取6孔板中3個(gè)孔的細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，按照先后順序加入無血清低糖（5mmol·L^-1）DMEM培養(yǎng)液、無血清高糖（25mmol·L^-1）DMEM培養(yǎng)液、低糖（5mmol·L^-1）DMEM培養(yǎng)液以及氯化鉀（30mmol·L^-1）溶液。孵育50min后收集上清液。使用Canine Insulin ELISA Kit對(duì)上清液的胰島素分泌量進(jìn)行測(cè)定；接著按照上述分組，收集兩組細(xì)胞樣進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)Pdx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pcsk1、Pcsk2和Ins的表達(dá)。

1.3 Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx6.1重編程犬AMSCs向IPCs分化

構(gòu)建pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3（A）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4（B）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1（C）三種多基因共表達(dá)腺病毒載體，空載體感染為陰性對(duì)照。分別接種犬AMSCs后體外誘導(dǎo)其向IPCs分化，隔天換液，持續(xù)誘導(dǎo)25d后，進(jìn)行胰島樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)量、直徑及細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)。同時(shí)進(jìn)行雙硫腙染色和糖刺激試驗(yàn)，其中糖刺激試驗(yàn)按照犬胰島細(xì)胞組、犬AMSCs組、空載體組、載體A組、載體B組、載體C組分為6組，具體方法同“1.2”。然后按照犬胰島細(xì)胞組、空載體組、載體A組、載體B組、載體C組分為5組，在誘導(dǎo)后第25天分別收集細(xì)胞樣，進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)Pdx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pcsk1、Pcsk2和Ins的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒感染犬AMSCs及體外誘導(dǎo)其向IPCs分化效果2.1.1 細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化后的雙硫腙染色圖及明場(chǎng)圖

誘導(dǎo)25d的犬ADSCs形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，直徑約為100.76μm±2.28μm，DTZ染色后呈猩紅色（圖1A）。

2.1.2 胰島素分泌量及胰島素刺激指數(shù)檢測(cè)

胰島素分泌量的檢測(cè)結(jié)果顯示，在低糖刺激下，Hnf1b+誘導(dǎo)程序組和單純誘導(dǎo)組的胰島素分泌量相近，無顯著性差異。在高糖刺激下，Hnf1b+誘導(dǎo)程序組胰島素分泌量極顯著高于單純誘導(dǎo)組（Plt;0.001）。在KCl刺激下，趨勢(shì)與高糖刺激一致。Hnf1b+誘導(dǎo)程序組的胰島素刺激釋放指數(shù)極顯著高于單純誘導(dǎo)組（Plt;0.001）（圖2）。

2.1.3 胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況

由與IPCs發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果可見，Hnf1b+誘導(dǎo)程序組中Nkx6.1基因和Ins基因的mRNA表達(dá)量極顯著高于單純誘導(dǎo)組（Plt;0.001），Pdx1基因和Nkx2.2基因的mRNA表達(dá)量高于單純誘導(dǎo)組（Plt;0.05）（圖3）。

2.2 多基因共表達(dá)腺病毒感染犬AMSCs誘導(dǎo)其向IPCs分化效果2.2.1 犬AMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后的雙硫腙染色圖及明場(chǎng)圖

犬ADSCs誘導(dǎo)25d后，A組、B組、C組的犬AMSCs均形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，DTZ染色后呈猩紅色，A組和C組的著色較淺。A組、B組、C組的成團(tuán)數(shù)量極顯著高于空載體組（Plt;0.001），其中，B組中的胰島樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)量最多，極顯著高于A組（Plt;0.001），平均為（128±6）·10^-6細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)直徑為106.22μm±11.79μm，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)約有（121±16）個(gè)細(xì)胞。（圖4、5）。

2.2.2 胰島素分泌量及胰島素刺激指數(shù)檢測(cè)

胰島素分泌量的檢測(cè)顯示，A組、B組、C組和對(duì)照組在低糖刺激下胰島素分泌量均極顯著低于犬胰島細(xì)胞（Plt;0.001），B組和C組的胰島素分泌量極顯著高于A組（Plt;0.001）。在高糖刺激下，犬胰島細(xì)胞的胰島素分泌量極顯著高于A組、B組、C組和對(duì)照組，且B組極顯著高于A組和C組（Plt;0.001），C組極顯著高于A組（Plt;0.001）。在KCl低糖刺激下，變化趨勢(shì)與高糖刺激一致。犬胰島細(xì)胞組（2.71±0.08）的胰島素刺激釋放指數(shù)均極顯著高于A組、B組和C組（Plt;0.001），B組顯著高于A組和C組（Plt;0.01）（圖6）。

2.2.3 胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況

由胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果可見，犬胰島細(xì)胞組中的8個(gè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量均極顯著高于A組、B組、C組和空載體組（Plt;0.001）。A、B、C三組Pdx1基因表達(dá)量較空載體組極顯著升高（Plt;0.001），B組顯著高于A組（Plt;0.01）；A、B、C三組MafA基因和Nkx6.1基因較空載體組顯著升高（Plt;0.01）；Nkx2.2基因表達(dá)量C組高于空載體組（Plt;0.05），A組、B組和空載體組無明顯差異性；Pax4基因A組表達(dá)量高于空載體組（Plt;0.05），B組極顯著高于空載體組（Plt;0.001），高于C組（Plt;0.05）；Pcsk1基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B組極顯著高于A組和C組（Plt;0.001），C組極顯著高于空載體組（Plt;0.001）；A、B、C三組Pcsk2基因較空載體組顯著升高（Plt;0.01）；Ins基因檢測(cè)結(jié)果顯示，A組極顯著高于空載體組（Plt;0.001），B組高于A組（Plt;0.05）（圖7）。

3 討 論

自體IPCs的移植可能是一種理想的糖尿病治療方法，可以克服目前胰島移植的局限性，包括供體短缺，同種異體移植的免疫反應(yīng)以及移植物存活率低等^[13]。由于AMSCs具有免疫抑制特性和低免疫原性等特點(diǎn)^[14]，使其成為重編程獲得IPCs的重要來源。Hnf1b是胰腺器官發(fā)生期間，在β細(xì)胞發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它對(duì)調(diào)節(jié)成年胰腺中控制β細(xì)胞功能的基因表達(dá)起著至關(guān)重要的作用^[15]。有研究表明，Hnf1b是轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)節(jié)劑，該轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)控制著胰腺的規(guī)格，形態(tài)發(fā)生以及內(nèi)分泌細(xì)胞的分化。Hnf1b基因可激活Hnf1a，調(diào)節(jié)Ptf1a表達(dá)，Hnf1a可進(jìn)一步激活Pdx1和胰島素的表達(dá)，也可直接與Ins相互作用。因此，本試驗(yàn)選用犬AMSCs作為種子細(xì)胞，通過對(duì)Hnf1b基因的腺病毒表達(dá)載體進(jìn)行過表達(dá)處理，以此來說明Hnf1b基因的過表達(dá)對(duì)犬AMSCs向IPCs分化效率的影響。結(jié)果顯示，Hnf1b基因的過表達(dá)可提高Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2和Ins的內(nèi)源性表達(dá)，其中，Nkx6.1和Ins的表達(dá)量顯著升高，該結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致^[15-16]。

在胰腺發(fā)育過程中，Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx6.1均有至關(guān)重要的調(diào)控作用。由相關(guān)因素和相關(guān)信號(hào)通路的共同作用引起的Pdx1激活可引起MSCs向胰腺β樣細(xì)胞分化，表明Pdx1在胰腺細(xì)胞中起著轉(zhuǎn)錄主開關(guān)的作用^[17]。但是，研究還表明僅Pdx1不能有效誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞分化為成熟的胰腺β細(xì)胞。因此，需要Pdx1和其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。MafA可直接激活β細(xì)胞系中的胰島素，并在成年β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Nkx2.2和Nkx6.1是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)劑。Nkx6.1指導(dǎo)分泌胰島素的β細(xì)胞的分化，抑制胰高血糖素的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)胰島素激活，而Nkx6.1的下調(diào)誘導(dǎo)相反的作用^[18]。Pax4是胰腺發(fā)育和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌分化過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)MafA、Nkx6.1和其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并誘導(dǎo)胰腺祖細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞，從而增強(qiáng)胰島素的轉(zhuǎn)錄和合成^[19]。Pcsk1和Pcsk2是將胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素的關(guān)鍵蛋白^[20]。在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)構(gòu)建多基因表達(dá)載體組合A：Hnf1b-Pdx1-Ngn3；組合B：Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4；組合C：Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1，探究各組合對(duì)犬AMSCs向IPCs分化效率的影響。RT-qPCR結(jié)果顯示，A、B、C三組的Pdx1、MafA、Nkx6.1、Pcsk2和Ins表達(dá)量較空載體組極顯著升高（Plt;0.001）。B組Pdx1基因和Pcsk1基因表達(dá)量高于A組和C組，Ins基因表達(dá)量B組高于A組（Plt;0.05）。組合B和組合C中不一樣的基因是Pax4和Nkx6，可能是兩者誘導(dǎo)效果不同的重要原因。Zhang等^[21]研究表明，與單獨(dú)的Ad-Pdx1-Ngn3-MafA相比，與Ad-Pax4和Ad-Pdx1-Ngn3-MafA共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)更高水平的Ins和C肽，并且在高葡萄糖刺激下分泌更多的胰島素。本研究結(jié)果還表明，Pax4、Nkx6.1均與其他基因有協(xié)同作用，可促進(jìn)犬AMSCs分化為功能性IPCs。根據(jù)以上結(jié)果可以確定組合B的誘導(dǎo)效果最好，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明該組合誘導(dǎo)的犬AMSCs可分泌胰島素。

雖然本試驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)效果最佳的組合B，但是該組合的胰島素分泌量以及胰島發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于犬胰島細(xì)胞，高糖刺激下的胰島素分泌量約為犬胰島細(xì)胞的1/3，而且與單基因誘導(dǎo)程序組相比，胰島素分泌量與相關(guān)基因表達(dá)量相近甚至更低，可能是由同一轉(zhuǎn)錄因子在不同的發(fā)育階段所發(fā)揮的作用不同引起的。Czubak等^[22]發(fā)現(xiàn)高濃度的葡萄糖是將MSCs分化為IPCs的主要因素，并且添加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子濃度對(duì)于IPCs的分化效率至關(guān)重要，生長(zhǎng)因子濃度增加到一定水平以上并不會(huì)增加分化細(xì)胞的百分比。因此可通過額外添加化學(xué)物質(zhì)（例如煙酰胺、生長(zhǎng)因子），調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)時(shí)間或改善細(xì)胞微環(huán)境來提高誘導(dǎo)效率。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)Hnf1b腺病毒表達(dá)載體在犬AMSCs中進(jìn)行過表達(dá)處理，確定了Hnf1b對(duì)體外誘導(dǎo)犬AMSCs向IPCs分化具有促進(jìn)作用。同時(shí)成功構(gòu)建了三種不同組合的多基因共表達(dá)腺病毒載體，并通過對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果的分析，表明Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4組合調(diào)控犬AMSCs向IPCs分化過程更高效。本研究結(jié)果為開發(fā)一種安全、新穎的糖尿病治療方法提供了可能。

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（編輯 白永平）