吳偉勝+李玉保+王守榮等
摘要: 大腸桿菌病為畜牧養(yǎng)殖業(yè)常見(jiàn)疾病之一,目前臨床上主要依賴于抗生素進(jìn)行控制。隨著大腸桿菌耐藥性增強(qiáng)以及人們對(duì)食品安全意識(shí)的提高,急需尋找安全、高效的抗生素替代品。噬菌體是能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱,具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外有關(guān)大腸桿菌噬菌體的分布、分離純化方法、保存方法、形態(tài)、pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、分子生物學(xué)以及應(yīng)用方面作了簡(jiǎn)要概述,并對(duì)以后的科研和應(yīng)用進(jìn)行了思考和展望。
關(guān)鍵詞: 大腸桿菌;噬菌體;研究進(jìn)展
中圖分類號(hào):S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A[HK]
文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0008-03
近年來(lái),由于畜牧養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素,導(dǎo)致病原微生物的耐藥性升高 [1],同時(shí),抗生素的使用對(duì)食品安全構(gòu)成威脅。噬菌體作為一類能夠感染和裂解大腸桿菌等微生物的病毒,具有宿主專一、不產(chǎn)生耐藥性 [2]、使用安全 [3-4]等優(yōu)勢(shì),在美國(guó)已應(yīng)用于兒童腹瀉疾病的治療 [5]。因此,噬菌體有望在防控畜牧業(yè)腸道性疾病中替代抗生素。本文對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外關(guān)于大腸桿菌噬菌體的分離和保存方法、生物學(xué)特性等進(jìn)行綜述,希望能夠?qū)Υ竽c桿菌噬菌體更深入的研究和應(yīng)用提供思路和方法。
1 大腸桿菌噬菌體的分布
目前研究發(fā)現(xiàn)的病毒種類數(shù)量龐大,其中大部分是噬菌體 [6]。大腸桿菌噬菌體在我們生活的周圍環(huán)境中普遍存在。到目前為止,學(xué)者們已經(jīng)從不同的樣品中分離出來(lái)多種大腸桿菌噬菌體,并對(duì)所分離的噬菌體進(jìn)行了分類和命名。在養(yǎng)殖場(chǎng)的雞糞 [7-8]和污水中 [9],以不同的大腸桿菌為宿主菌分離到不同種類的大腸桿菌噬菌體;在養(yǎng)豬場(chǎng)的糞便中,以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K88 為宿主菌分離并純化了1株噬菌體PK88-4 [10];在城市的污水中,以腸出血性大腸桿菌O157 ∶ H7為宿主菌分離出裂性噬菌體 [11]。此外,在醫(yī)院的污水中,用大腸桿菌E1~ E17共17種細(xì)菌做指示菌分離出1種廣譜噬菌體IME11 [12]。
2 大腸桿菌噬菌體的分離純化方法
對(duì)于噬菌體的分離純化,大致可以分為采樣、富集、分離、純化4個(gè)步驟。每個(gè)步驟又包含1種或多種不同的方法,可以根據(jù)自身的試驗(yàn)條件和試驗(yàn)狀況將不同方法組合,進(jìn)而得到最佳的分離純化方法。
2.1 采樣
采樣大致可以分為直接法、間接法和誘導(dǎo)法 [13]3種。直接法是指直接從對(duì)象菌生活的生物體上采集樣本的方法。李灝等 [14]、Connerton [15]都采用直接法從發(fā)病雞的腸道中采樣并分別分離出大腸桿菌噬菌體和空腸彎曲桿菌噬菌體。間接法是指根據(jù)對(duì)象菌的特性,從相應(yīng)的非生物壞境中采集樣本的方法。如從養(yǎng)雞場(chǎng)的污水、糞便和土壤中采樣進(jìn)而分離噬菌體 [8-9,16-17]。誘導(dǎo)法是指用對(duì)象菌去感染生物體進(jìn)而在生物體或其生活環(huán)境中采樣的方法。郭海萍等用痢疾志賀氏菌感染小鼠,采取小鼠的糞便進(jìn)而分離得到相應(yīng)噬菌體。
2.2 富集
富集也稱增殖,即將對(duì)象菌懸液與樣品液共同培養(yǎng),增加樣品液中噬菌體的含量,富集之后的樣品液更易分離出噬菌體。郭秋菊等從生活污水中采樣分離噬菌體,進(jìn)行了富集和不富集的對(duì)照試驗(yàn),結(jié)果顯示,富集之后的樣品很容易檢測(cè)到噬菌體,而不經(jīng)富集的樣品未檢測(cè)到噬菌體 [19]。雖然不經(jīng)富集的樣品中未檢測(cè)到噬菌體,但并不表示樣品中不含噬菌體。
2.3 分離
分離方法可以分為雙層瓊脂平板法、瓊脂平板涂布法、瓊脂平板傾注法3種 [13]。各種方法有自己的優(yōu)缺點(diǎn),學(xué)者們通常根據(jù)自己的試驗(yàn)條件和操作習(xí)慣進(jìn)行選擇。
2.4 純化
純化可以分為液體純化法和平板純化法 [13]。液體純化法中,用無(wú)菌槍頭或牙簽挑單個(gè)噬菌斑,然后接入含對(duì)象菌的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行適溫培養(yǎng),再經(jīng)過(guò)濾除菌即得到純化噬菌體 [20]。平板純化法中,也是用無(wú)菌槍頭或牙簽挑單個(gè)噬菌斑于緩沖液進(jìn)行洗脫,洗脫液經(jīng)適當(dāng)稀釋后再用雙層瓊脂平板法、瓊脂平板涂布法或瓊脂平板傾注法進(jìn)行培養(yǎng),如此操作 3~5次,即可得到純化噬菌體 [10,19]。
3 大腸桿菌噬菌體的保存方法
在對(duì)噬菌體的保存方法上,研究學(xué)者們嘗試過(guò)很多種方法,不同的保存方法對(duì)噬菌體活性的保持影響很大。
陳萍等取3組500 μL噬菌體裂解液:第一組加入了 100 μL 氯仿,第二組加入500 μL LB液體培養(yǎng)基,第三組加入CaCl2和MgCl2至終濃度10 mmol/L、0. 1%明膠, 4 ℃ 保存1個(gè)月,結(jié)果顯示第三組噬菌體的活性很少降低,效價(jià)最高 [21]。
有很多關(guān)于-18 ℃保存噬菌體的研究。陳海陽(yáng)將1株廣譜大腸桿菌噬菌體EX01裂解液放于-18 ℃低溫保存,每隔一周測(cè)定其效價(jià),結(jié)果顯示噬菌體EX01在35 d時(shí)仍具有較高的效價(jià),56 d時(shí)仍有感染性,63 d時(shí)感染性消失 [13]。郭秋菊等對(duì)比了在-18 ℃保存已純化的噬菌體平板或噬菌體懸液的2種方法。結(jié)果顯示,2種方法都能保存1個(gè)月以上,但平板保存法優(yōu)于噬菌體懸液保存法 [19]。
另外報(bào)道顯示,T4-Like大腸桿菌噬菌體在10 mmol/L的鎂離子中,30 ℃保存超過(guò)1個(gè)月,效價(jià)都沒(méi)有降低 [22]。
4 大腸桿菌噬菌體的形態(tài)
噬菌體個(gè)體微小,不具有細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu),只含有單一核酸。噬菌體按蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以分為無(wú)尾部的二十面體、有尾部的二十面體和線狀體3種。無(wú)尾部的噬菌體外表由蛋白外殼組成,核酸被包裹在內(nèi)部。有尾部的噬菌體除了頭部外,還有尾部和基部:尾部由1個(gè)中空的針狀結(jié)構(gòu)及外鞘組成,基部由尾絲和尾針組成。線狀體噬菌體沒(méi)有明顯的頭部結(jié)構(gòu),而是由殼粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu)。
已知的噬菌體大多都是有尾部的二十面體。許多研究人員分別對(duì)從養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中、河水中和污水中分離出的噬菌體進(jìn)行了電鏡拍照,照片顯示噬菌體都由頭部和尾部組成,且頭部呈正多面體狀,直徑45~95 nm,尾部粗長(zhǎng)、含有尾鞘,長(zhǎng)100~120 nm [7,10-11,23-24]。
此外,郭秋菊等從生活污水中分離了3種類型的噬菌體,經(jīng)電鏡拍照顯示:一種類型的噬菌體尾部不能收縮,頭部為二十面體,直徑110~120 nm,尾長(zhǎng)220~230 nm,尾寬13~15 nm,沒(méi)有尾鞘、基板、尾丁、尾絲;一種類型的噬菌體尾部可以收縮,頭部為三十面體,直徑70~110 nm,尾長(zhǎng)120~130 nm,尾寬18~22 nm,有尾鞘、基板、尾丁和尾絲結(jié)構(gòu);一種類型為短尾噬菌體,頭部直徑約20 nm,尾長(zhǎng)2~3 nm [19]。
5 大腸桿菌噬菌體穩(wěn)定性
5.1 pH值穩(wěn)定性
噬菌體生長(zhǎng)和其他微生物一樣,除了其他必要的生長(zhǎng)條件外,還需要有適合其生長(zhǎng)的pH值。在其他生長(zhǎng)條件相同的情況下,pH值不同對(duì)噬菌體生長(zhǎng)的影響也不同。何覓之將Bp9B1226噬菌體純培養(yǎng)液分別加入不同pH值(4、5、6、7、8、9、10、11)的LB液體培養(yǎng)基中,放于37 ℃恒溫水浴24小時(shí),用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià),結(jié)果顯示Bp9B1226噬菌體在pH值=6~9時(shí),噬菌體效價(jià)指數(shù)無(wú)明顯變化,當(dāng)pH值<5或pH值>10時(shí),噬菌體效價(jià)指數(shù)明顯下降 [25]。另外,代保英對(duì)大腸桿菌噬菌體BpD的pH值的穩(wěn)定性也做了類似的試驗(yàn),結(jié)果顯示:在pH值=5~9時(shí),噬菌體BpD活性較高,尤其在pH值=7~8時(shí),活性最高;在pH值<5或pH值>9時(shí),活性明顯下降 [26]。由此看出,大腸桿菌噬菌體對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較廣。
5.2 溫度穩(wěn)定性
溫度對(duì)噬菌體的感染力有很大影響,找到噬菌體保持感染力的溫度范圍,將會(huì)對(duì)進(jìn)行噬菌體更深入的研究與應(yīng)用起到關(guān)鍵作用。張培東等對(duì)大腸桿菌噬菌體Bp6的熱穩(wěn)定性做了測(cè)定,他們將具有一定效價(jià)的噬菌體Bp6懸液分別經(jīng)40、50、60、70、80、90 ℃水浴30 min和1 h,隨即將懸液冰浴冷卻測(cè)其效價(jià),結(jié)果顯示噬菌體Bp6在40 ℃下作用30 min和 1 h 活性基本不變,50 ℃和60 ℃下作用 30 min 和1 h仍有較高活性,70 ℃下作用30 min和1 h基本失去活性,80 ℃和90 ℃下作用30 min和1 h完全失去活性 [7]。何覓之 [25]和代保英 [26]也分別對(duì)相應(yīng)的大腸桿菌噬菌體做了類似試驗(yàn),結(jié)果顯示,噬菌體對(duì)溫度的穩(wěn)定性比較高,但長(zhǎng)時(shí)間處于70 ℃以上高溫,噬菌體的活性會(huì)迅速降低以至失去。
6 大腸桿菌噬菌體分子生物學(xué)
噬菌體所含的核酸可以分為4種:?jiǎn)捂淩NA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)。
在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn),多數(shù)大腸桿菌噬菌體的遺傳物質(zhì)為DNA。尹雅菲等對(duì)分離出的1種寬譜噬菌體IME11做了遺傳物質(zhì)的鑒定,他們分別用DNaseⅠ和RNaseA 處理噬菌體IME11的遺傳物質(zhì),證明噬菌體IME11的遺傳物質(zhì)為DNA,并用限制性內(nèi)切酶處理其遺傳物質(zhì),證明其遺傳物質(zhì)為dsDNA [12]。同時(shí),王冉等對(duì)分離出的1株噬菌體PK88-4也做了基因組分析及酶切鑒定,證明噬菌體PK88-4的遺傳物質(zhì)為dsDNA,基因組大小約為60 kb [10]。
此外,有些關(guān)于大腸桿菌噬菌體的研究顯示,其遺傳物質(zhì)為RNA。徐焰等對(duì)1株分離自醫(yī)院污水的寬宿主譜大腸桿菌噬菌體和1株單一宿主譜噬菌體f2進(jìn)行了遺傳物質(zhì)測(cè)定,結(jié)果顯示,寬宿主譜大腸埃希菌噬菌體和f2 噬菌體均為 6 000 bp 左右的單鏈RNA [27]。
7 大腸桿菌噬菌體的噬菌譜
根據(jù)噬菌體的噬菌譜不同,可以大致將噬菌體分為寬宿主譜噬菌體和專一宿主噬菌體。
寬宿主譜噬菌體是指能夠裂解多種宿主菌的噬菌體。徐焰等從醫(yī)院污水中分離出1株大腸桿菌噬菌體,經(jīng)宿主范圍測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該噬菌體可以裂解5株大腸桿菌,所以可以確定該噬菌體為大腸桿菌寬宿主譜噬菌體 [28]。此外,王禮偉等 [9]和杜崇濤等 [11]也分別從養(yǎng)雞場(chǎng)污水和城市污水中分離出了大腸桿菌寬宿主譜噬菌體。
專一宿主噬菌體是指只能夠裂解專一宿主菌的噬菌體。因其具有嚴(yán)格的宿主專一性,在細(xì)菌的檢測(cè)、細(xì)菌分型以及特異性裂解方面都有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì) [29]。
8 大腸桿菌噬菌體的安全性
[JP3]和抗生素相比,噬菌體不易造成細(xì)菌的抗性。相關(guān)性研究表明,細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的突變頻率為10 -7,產(chǎn)生抗性的幾率很小 [30],而且噬菌體也可以為適應(yīng)宿主菌產(chǎn)生適當(dāng)?shù)淖儺?[2]。
噬菌體在清除宿主菌的同時(shí),也不會(huì)影響動(dòng)物體內(nèi)周圍的正常菌群。Chibani-Chennoufi等用4種大腸桿菌噬菌體飼喂小鼠,結(jié)果顯示噬菌體幾乎對(duì)正常菌群沒(méi)有影響 [31]。Bruttin等讓15個(gè)志愿者服用T4噬菌體,受試者均無(wú)不良反應(yīng),且沒(méi)有影響腸道內(nèi)正常菌群 [3]。
9 大腸桿菌噬菌體的應(yīng)用
噬菌體生物制劑在治療疾病中有很多的優(yōu)勢(shì):噬菌體的特異性強(qiáng),能專一地裂解宿主菌,且不會(huì)破壞一些正常菌群;噬菌體的增殖周期比較短,產(chǎn)生子代噬菌體的數(shù)量大,對(duì)疾病的治療會(huì)更加快速有效;在噬菌體將病原菌裂解之后,噬菌體會(huì)隨著病原菌的清除而自動(dòng)滅亡,不會(huì)殘留在動(dòng)物體內(nèi) [32]。Tanji等用3株廣譜噬菌體做成混合制劑,用于裂解體外培養(yǎng)的E. coli O157:H7菌,結(jié)果顯示噬菌體混合制劑成功裂解了E. coli O157:H7 菌,同時(shí)又把混合制劑飼喂被E. coli O157:H7 感染的小鼠,小鼠腸道的E. coli O157:H7菌也被完全裂解 [33]。Smith等用噬菌體Φ9882治療經(jīng)大腸埃希菌感染的小鼠,結(jié)果小鼠全部存活,而用生理鹽水的對(duì)照組小鼠全部死亡 [34]。Smith等用噬菌體B85/1、B85/2成功治愈了小牛大腸埃希菌引起的腹瀉 [35]。
10 展望
在抗生素使用泛濫的時(shí)代,耐藥菌株增長(zhǎng)的速度也越來(lái)越快。噬菌體作為一種生物制劑,無(wú)疑會(huì)在畜禽疾病的防治上起到很好的作用。到目前為止,全國(guó)各地的科研人員和技術(shù)人員在大腸桿菌噬菌體方面做了大量的工作,并取得了可喜的成果。但是,噬菌體在臨床上的應(yīng)用還有很漫長(zhǎng)的科研之路。開(kāi)發(fā)能對(duì)應(yīng)相關(guān)疾病的噬菌體試劑或混合制劑,在某些情況下避免生物體內(nèi)的非特異性免疫反應(yīng),這些都是擺在我們面前的難題。同時(shí),由于噬菌體對(duì)宿主的高度特異性,尋找寬宿主譜噬菌體,研究噬菌體的溶壁酶都是我們努力的方向。相信在廣大科研技術(shù)工作人員的共同努力下,噬菌體一定能在畜禽疾病防治方面起到重要的作用。
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