摘 要：旨在建立一種副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP）精準(zhǔn)快速的檢測(cè)方法，結(jié)合重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（recombinase-aid amplification，RAA）和側(cè)向流試紙條（lateral flow dipstick，LFD）技術(shù)，以MAP的特異性多拷貝插入元件IS900設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和溫度等條件，建立可用于MAP現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)的RAA-LFD方法。該檢測(cè)方法在35℃條件下恒溫反應(yīng)30min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)MAP目的基因的有效擴(kuò)增。試驗(yàn)結(jié)果顯示：該方法可特異性地檢測(cè)出MAP，不與其他常見(jiàn)的病原發(fā)生交叉反應(yīng)；對(duì)MAP標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限可達(dá)到10fg·μL^-1；使用該方法對(duì)149份牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)的PCR相比，其敏感性為100%。綜上，本研究成功建立了一種針對(duì)于MAP的精準(zhǔn)快速的試紙條檢測(cè)方法，并具有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：副結(jié)核分枝桿菌；重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增；側(cè)向流試紙條

中圖分類號(hào)：S852.618

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3255-06

收稿日期：2023-10-07

基金項(xiàng)目：“十四五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFD1800703）

作者簡(jiǎn)介：南 岳（2000-），男，河南周口人，碩士，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：2965008308@qq.com；龍美貞（1998-），女，土家族，重慶酉陽(yáng)人，碩士，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：1727293215@qq.com。南岳和龍美貞為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：周向梅，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：zhouxm@cau.edu.cn

Establishment and Preliminary Application of Recombinase-mediated Amplification-

sidestream Detection for Detection of Mycobacterium paratuberculosis

NANYue，LONGMeizhen，WANGYuanzhi，LIUYiduo，ZHOUXiangmei^*

（National Key Laboratory of Veterinary Public Health and Safety，College of

Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Abstract：To establish arapid and accurate method for detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis（MAP），primers and probes were designed according to the specific multicopy insert element IS900of MAP.A recombinase-aid amplification combined with lateral flow dipstick（RAA-LFD）method was established for visual detection of MAP in the field within30min at35℃after being optimized.The assay was specific with the target sequence of MAP with adetection limit up to10fg·μL^-1.One hundred and forty-nine stool samples were tested by this method，showing100%sensitivity with the PCR.In short，the RAA-LFD assay developed in this study was arapid，reliable method which can be broadly used.

Key words：Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis; recombinase-aid amplification; lateral flow dipstick

*Corresponding author：ZHOU Xiangmei，E-mail：zhouxm@cau.edu.cn

副結(jié)核?。≒aratuberculosis）是由鳥(niǎo)分枝桿菌種副結(jié)核亞種的副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動(dòng)物消耗性疾病，表現(xiàn)為慢性增生性腸炎^[1]。MAP呈革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色陽(yáng)性，細(xì)胞壁較厚^[2]。這種保護(hù)性細(xì)胞壁和聚團(tuán)生長(zhǎng)的特性使MAP具有較強(qiáng)的環(huán)境抵抗力^[3]。MAP主要通過(guò)糞-口途徑傳播，經(jīng)消化道感染同群或其它健康動(dòng)物，除此之外，也可經(jīng)母乳傳播^[4-6]。

該病被認(rèn)為是為對(duì)奶牛行業(yè)產(chǎn)生危害最嚴(yán)重的疾病之一。我國(guó)于1953年在內(nèi)蒙古自治區(qū)的呼萌謝爾塔拉牧場(chǎng)首次報(bào)道，之后該病逐漸開(kāi)始在我國(guó)大范圍傳播^[7]。然而，其檢測(cè)手段尚不完善，主要是基于MAP病原學(xué)和宿主對(duì)病原的免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，在大多數(shù)國(guó)家對(duì)牛、羊等易感動(dòng)物的控制程序中，最常見(jiàn)的診斷方法是血清ELISA、糞便PCR或病原培養(yǎng)和病理學(xué)觀察。糞便培養(yǎng)被廣泛認(rèn)為是診斷副結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于處于感染早期的動(dòng)物，該方法檢出率較低^[8]。我國(guó)在2011年發(fā)布了《副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》（GB/T27637—2011），但操作較為復(fù)雜，對(duì)樣品要求較高。目前，主流的檢測(cè)方法都有一定缺點(diǎn)，且不適用于獸醫(yī)臨床基層，這阻礙了副結(jié)核病的凈化。因此，開(kāi)發(fā)適用于臨床的檢測(cè)方法對(duì)副結(jié)核病的凈化具有重要意義。

近年來(lái)，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（recombinase aided amplification，RAA）技術(shù)逐漸被應(yīng)用到病原檢測(cè)的研究中，該技術(shù)主要利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程，不需要依賴熱循環(huán)設(shè)備，37℃左右擴(kuò)增20～30min即可^[9]。本試驗(yàn)將RAA技術(shù)與側(cè)向流試紙條（lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合^[10]，開(kāi)發(fā)出針對(duì)MAP的快速檢測(cè)方法，無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室儀器，可滿足牛場(chǎng)對(duì)MAP快速、現(xiàn)場(chǎng)化的檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 菌株和樣品

副結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株MAP K-10、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）、志賀菌（Shigella Castellani）、沙門菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）均來(lái)源于國(guó)家傳染性海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室。待檢牛奶樣品來(lái)源于北京某牛場(chǎng)。

1.2 主要儀器和試劑

7H9培養(yǎng)基（美國(guó)BD Biosciences公司）；7H10培養(yǎng)基（美國(guó)BD Biosciences公司）；OADC Enrichment（美國(guó)BD Biosciences公司）；柱式分枝桿菌DNA提取試劑盒（北京百奧萊博科技公司）；RAA-basic檢測(cè)試劑盒（杭州眾測(cè)生物科技有限公司）；RAA-nfo核酸擴(kuò)增試劑（試紙條型）（杭州眾測(cè)生物科技有限公司）；一次性核酸檢測(cè)試紙條（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司）。

1.3 MAP的培養(yǎng)及基因組的提取

以MAP標(biāo)準(zhǔn)株的全基因組作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)室保存的MAP標(biāo)準(zhǔn)株K-10均勻涂布于7H10固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)2～3周至長(zhǎng)出單菌落。將單菌落接種于7H9液體培養(yǎng)基中，37℃180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)期（OD_600nm為0.6～0.8）。參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（北京百奧萊博科技公司）提取MAP的全基因組DNA，于-80℃儲(chǔ)存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

對(duì)GenBank上MAP的IS900基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，以確定該基因的保守區(qū)域。根據(jù)RAA技術(shù)的引物設(shè)計(jì)原則（具體見(jiàn)RAA-basic-檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)），利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)RAA引物，同時(shí)，在下游引物5′端用生物素（抗原標(biāo)記物）標(biāo)記。

根據(jù)引物對(duì)設(shè)計(jì)探針（Probe），探針長(zhǎng)度在46～52nt，5′端用FAM基團(tuán)（抗原標(biāo)記物）標(biāo)記，內(nèi)部含有‘dSpacer’（堿基核苷酸類似物四氫呋喃殘基，有時(shí)稱為THF-）；3′端有C3-spacer（聚合酶延伸阻斷基團(tuán)）。引物及探針由金唯智生物科技公司合成（序列見(jiàn)表1）。

1.5 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

按照眾測(cè)生物RAA-basic檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制擴(kuò)增體系：反應(yīng)干粉1管，25μL ABuffer，1.5μL濃度為2μmol·L^-1的上、下游引物，0.5μL濃度為2μmol·L^-1的探針，5μL DNA樣品或待檢樣品，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)至47.5μL。B Buffer需要添加至反應(yīng)試管蓋上，反應(yīng)開(kāi)始前蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次，充分混勻后低速離心10s（一定要混合均勻）；此后馬上移至水浴鍋中。首先優(yōu)化反應(yīng)溫度，將反應(yīng)時(shí)間控制在30min，設(shè)置反應(yīng)溫度為39、35、30、25、20、15℃，同時(shí)設(shè)置以無(wú)核酸酶水為DNA模板的陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)。其次優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，以最佳反應(yīng)溫度孵育，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為35、30、25、20、15min，同時(shí)設(shè)置以無(wú)核酸酶水為DNA模板的陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 特異性試驗(yàn)

使用本研究建立的MAP IS900RAA-LFD方法分別對(duì)MAP、E.coli、M.bovis、Shigella Castellani、Salmonella、S.aureus核酸進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置MAP標(biāo)準(zhǔn)株全基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照。

1.7 敏感性試驗(yàn)

用無(wú)核酸酶水10倍倍比稀釋“1.3”中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品，控制DNA濃度為1ng·μL^-1～1fg·μL^-1，取1μL為模板，同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RAA-LFD反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的靈敏性。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的RAA-LFD方法對(duì)臨床收集的牛奶（149份）樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

首先，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為30min，設(shè)置反應(yīng)溫度為39、35、30、25、20、15℃，以無(wú)核酸酶水為DNA模板的陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，檢測(cè)線最明顯，擴(kuò)增效果最好。

隨后，將反應(yīng)溫度控制在35℃，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為35、30、25、20、15min，以無(wú)核酸酶水為DNA模板的陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，擴(kuò)增效果最好。因此，設(shè)置35℃恒溫?cái)U(kuò)增30min為后續(xù)試驗(yàn)最佳反應(yīng)條件。

2.2 特異性試驗(yàn)

使用本研究建立的檢測(cè)方法分別對(duì)MAP、E.coli、M.bovis、Shigella Castellani、Salmonella、S.aureus進(jìn)行檢測(cè)，以MAP標(biāo)準(zhǔn)株K-10全基因組為陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照進(jìn)行參考。結(jié)果（圖1）顯示，只有MAP擴(kuò)增產(chǎn)物的試紙條才會(huì)在檢測(cè)區(qū)域出現(xiàn)條帶，其他均為陰性，說(shuō)明本方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

使用“1.3”中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的梯度稀釋，選取1ng·μL^-1～1fg·μL^-1共6個(gè)濃度各1μL為模板，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RAA-LFD反應(yīng)。結(jié)果顯示，該方法的靈敏度10fg·μL^-1（圖2）。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

在149份牛奶樣品中，PCR檢測(cè)MAP陽(yáng)性33份，陰性116份；RAA-LFD法檢測(cè)MAP陽(yáng)性55份，陰性94份（表2），兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率=（33+94）/149×100%=85.23%。

3 討 論

1894年，德國(guó)科學(xué)家Johne和Frothinghaw首次在牛中發(fā)現(xiàn)副結(jié)核病，因此該病也稱約翰氏?。↗ohne’s disease，JD）^[11]。當(dāng)前我國(guó)副結(jié)核病流行情況形勢(shì)嚴(yán)峻，如何有效的對(duì)MAP進(jìn)行檢測(cè)是凈化副結(jié)核病的關(guān)鍵一步。目前對(duì)MAP的檢測(cè)局限于細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)，不論是靈敏度還是準(zhǔn)確性都還有巨大的提升空間。

本研究以IS900為靶向基因，建立了一種RAA-LFD檢測(cè)方法，可在20～30min完成對(duì)MAP的快速檢測(cè)。IS900是副結(jié)核分枝桿菌的特異性多拷貝插入元件，與其他IS元件相比IS900的拷貝數(shù)更高，使得基于IS900的檢測(cè)更加敏感，研究認(rèn)為IS900是各種基于PCR的分子檢測(cè)中特異性最強(qiáng)、靈敏度較高的序列^[12]，目前，已被用于開(kāi)發(fā)PCR^[13]、RT-qPCR^[14]和LAMP^[15]等。近年來(lái)，包括RAA方法在內(nèi)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展使得分子診斷更加可靠和簡(jiǎn)單，與PCR等其他檢測(cè)方法相比，RAA方法具有反應(yīng)程序簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，將RAA與LFD結(jié)合，使檢測(cè)結(jié)果可視化，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，可直接在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。許多學(xué)者將其用于開(kāi)發(fā)副結(jié)核病診斷，Hansen等^[16]建立了RPA方法，Punati等^[15]開(kāi)發(fā)了LAMP-LFD方法。此類簡(jiǎn)單、快速的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法也將逐步進(jìn)入牛副結(jié)核病的臨床應(yīng)用中。RAA的引物設(shè)計(jì)與RT-qPCR和普通PCR有所區(qū)別，且目前尚無(wú)專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，所以設(shè)計(jì)引物是建立RAA檢測(cè)方法的第一步，設(shè)計(jì)好的引物還需要檢測(cè)其可行性。同時(shí)在試驗(yàn)過(guò)程中也有一些需要注意的問(wèn)題，比如RAA-LFD十分靈敏，所以極其容易出現(xiàn)污染現(xiàn)象，因此操作人員在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)需要格外注意避免環(huán)境污染；在水浴鍋進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，要注意體系與水的接觸，確保反應(yīng)體系受熱均勻；蓋緊試管蓋子防止反應(yīng)體系暴露在水中等。

對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，該方法顯示出良好的檢測(cè)性能。一方面，該方法與致病性大腸桿菌、牛分枝桿菌、志賀菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)病原不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性良好。另一方面，RAA-LFD方法對(duì)副結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的靈敏度為10fg·μL^-1，比傳統(tǒng)PCR方法靈敏。

用PCR法和RAA-LFD法對(duì)149份牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)MAP陽(yáng)性33份，陰性116份；RAA-LFD法檢測(cè)MAP陽(yáng)性55份，陰性94份。這些觀察結(jié)果表明，與PCR相比，RAA-LFD法的臨床敏感性為100%。PCR陽(yáng)性結(jié)果低可能是由于牛奶中存在一些未知的因素^[17]，如蛋白酶等，但這些因素可能不會(huì)影響RAA檢測(cè)。另外，由于RAA-LFD方法具有非常高的靈敏性，易受到氣溶膠的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，而牛場(chǎng)的環(huán)境比實(shí)驗(yàn)室更容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因此，在牛場(chǎng)使用RAA-LFD檢測(cè)牛副結(jié)核時(shí)，要特別注意避免氣溶膠的產(chǎn)生。該方法可用于牛場(chǎng)副結(jié)核的初篩，結(jié)合其它方法如血清學(xué)及病原學(xué)檢測(cè)可進(jìn)一步確診。

4 結(jié) 論

本研究建立了檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌的RAA-LFD方法，試驗(yàn)結(jié)果表明這是一種簡(jiǎn)單、快速、易于進(jìn)行的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，可在資源有限、儀器設(shè)備簡(jiǎn)陋的基層或牧場(chǎng)檢測(cè)牛MAP，用于即時(shí)診斷，為副結(jié)核病的防治提供重要技術(shù)支撐。

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（編輯 白永平）