【摘 要】目的：從營衛(wèi)學說角度闡述濾泡輔助性T細胞（Tfh）/濾泡調(diào)節(jié)性T細胞（Tfr）失衡與類風濕關節(jié)炎中醫(yī)病機之間的聯(lián)系。方法：選取2021年9月至2022年12月在南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風濕免疫科就診的門診及住院類風濕關節(jié)炎患者62例，搜集患者一般情況、病史資料、中醫(yī)辨證信息及血清樣本。檢測符合入選標準患者的空腹Tfh細胞比例、Tfr細胞比例、白細胞介素（IL）-21水平，描述營衛(wèi)失調(diào)證候積分、Tfh細胞比例、Tfr細胞比例、Tfh/Tfr細胞比值與IL-21在類風濕關節(jié)炎患者中的分布，分析營衛(wèi)失調(diào)證候積分、Tfh細胞比例、Tfr細胞比例、Tfh/Tfr細胞比值、IL-21等指標之間的相關性。結(jié)果：類風濕關節(jié)炎患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分與年齡、病程、紅細胞沉降率、免疫球蛋白A、關節(jié)壓痛數(shù)、健康評估問卷評分、28個關節(jié)病情活動指數(shù)評分呈正相關（P < 0.05）；類風濕關節(jié)炎患者的Tfh/Tfr細胞比值、IL-21與營衛(wèi)失調(diào)證候積分呈正相關（P < 0.05），Tfr細胞與營衛(wèi)失調(diào)證候積分呈負相關（P < 0.05）。結(jié)論：營衛(wèi)失和是類風濕關節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的基本病機，影響患者病情。營衛(wèi)失和可與Tfh/Tfr細胞失衡對應，Tfh/Tfr細胞平衡可能屬于營衛(wèi)和調(diào)在現(xiàn)代理論下的具象體現(xiàn)。

【關鍵詞】 類風濕關節(jié)炎；營衛(wèi)學說；營衛(wèi)失和；濾泡輔助性T細胞；濾泡調(diào)節(jié)性T細胞

Exploring the Correlation Between Rheumatoid Arthritis and Tfh/Tfr Cell Imbalance Based on the Ying-Wei

Theory

YANG Qing-ya，ZHANG Fang，YANG Ning，CHEN Chang-yun，XU Chao

【ABSTRACT】Objective：To elucidate the relationship between rheumatoid arthritis and Tfh/Tfr cell imbalance based on the Ying-Wei Theory.Methods：Sixty-two outpatients and inpatients with rheumatoid arthritis were selected who visited the Rheumatology and Immunology Department of Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital from September 2021 to December 2022.General information，medical history，TCM syndrome differentiation information，and serum samples were collected from the patients.Detected the fasting Tfh cell and Tfr cell ratio，and interleukin-21 levels of patients who meet the inclusion criteria，described the ying-wei disharmony syndrome score，Tfh cell ratio，Tfr cell ratio，Tfh/Tfr cell ratio，and the distribution of IL-21 in RA patients，and analyzed the correlation between ying-wei disharmony syndrome score，Tfh cell ratio，Tfr cell ratio，Tfh/Tfr cell ratio，IL-21，and other indicators.Results：The ying-wei disharmony syndrome score of RA patients was positively correlated with age，disease duration，erythrocyte sedimentation rate，immunoglobulin A，number of joint tenderness，health assessment questionnaire，and

28 joint disease activity index（P < 0.05）;the Tfh/Tfr cell ratio and IL-21 in RA patients were positively correlated with the ying-wei disharmony syndrome score（P < 0.05），while Tfr cells were negatively correlated with the ying-wei disharmony syndrome score（P < 0.05）.Conclusion：Ying-wei disharmony is the fundamental pathogenesis of the occurrence and development of rheumatoid arthritis，which affects the patient's condition.Ying-wei disharmony can correspond to the imbalance of Tfh/Tfr cells，and the balance of Tfh/Tfr cells may be a concrete manifestation of ying-wei harmony in modern theory.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;the Ying-Wei Theory;ying-wei disharmony;Tfh cells;Tfr cells

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種抗原驅(qū)動、T細胞介導及遺傳相關的全身性自身免疫病，主要表現(xiàn)為侵蝕性關節(jié)炎。RA全球患病率為0.5%～1%［1］，我國大陸患病率為0.42%，其中女性較男性更普遍［2］?，F(xiàn)有研究表明，RA發(fā)生、發(fā)展過程中有多種免疫細胞參與，其中濾泡輔助性T細胞（Tfh）與濾泡調(diào)節(jié)性T細胞（Tfr）發(fā)揮著關鍵作用［3］。RA屬中醫(yī)學“痹證”“歷節(jié)”“尫痹”等范疇。從中醫(yī)學角度出發(fā)，營衛(wèi)失和是RA發(fā)生的重要內(nèi)因。本研究旨在探究RA營衛(wèi)失調(diào)證候積分與Tfh細胞/Tfr細胞失衡的相關性，從營衛(wèi)學說角度闡述Tfh/Tfr細胞失衡與RA中醫(yī)病機之間的聯(lián)系，為中醫(yī)藥補充治療RA提供思路和依據(jù)，亦為RA的發(fā)病機制研究提供支持。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2021年9月至2022年12月在南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風濕免疫科就診的門診及住院RA患者62例，其中男7例，女55例；年齡23～81歲，平均（56.47±13.90）歲；病程1～480個月，平均34.50（12.00，120.00）個月；8例患者有RA家族史，10例患者未經(jīng)治療。本研究方案獲得南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理號2021LWKYZ035）。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 按照1987年美國風濕病學會（ACR）或2010年ACR/歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）發(fā)布的RA診斷標準［4］。

1.2.2 中醫(yī)證候標準 按照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》［5］，結(jié)合古今RA辨證相關文獻，經(jīng)由課題組成員共同討論，3位主任醫(yī)師共同制定本研究營衛(wèi)失調(diào)癥狀分級量化積分表。營衛(wèi)失調(diào)證候主要癥狀包括肢冷畏寒、無汗、多汗、惡風、易感冒、發(fā)熱、四肢不仁、不寐、癰腫，每項癥狀根據(jù)嚴重程度分為無、輕度、中度、重度4級，分別計為0、1、2、3分?？偡肿罡?7分。

1.3 納入標準 ①符合上述診斷標準；②年齡18～85歲；③自愿簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①合并病毒性腦膜炎、獲得性免疫缺陷綜合征、肝炎、結(jié)核等疾病者；②合并彌漫性毒性甲狀腺腫、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、過敏性紫癜等其他自身免疫性疾病者；③合并嚴重糖尿病、心腦血管疾病、肝腎功能不全，以及血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病者；④懷疑或確有酒精、藥物濫用病史者；⑤根據(jù)研究者的判斷，具有降低入組可能性或使入組復雜化的其他病變或情況者。

2 方 法

2.1 資料搜集方法 ①一般資料：姓名、年齡、性別、職業(yè)、婚姻、家族史、既往病史等；飲酒、吸煙、飲食偏嗜、居住環(huán)境情況。②病史資料：RA病程，藥物使用情況。③體格檢查：身高、腰圍、體質(zhì)量、脈搏、呼吸、體溫、血壓、類風濕結(jié)節(jié)，計算體質(zhì)量指數(shù)。④收集患者就診時的實驗室指標資料：血常規(guī)、肝功能［谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白、球蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶］、腎功能（肌酐、尿酸、尿素氮）、血糖、超敏C反應蛋白（hs-CRP）、紅細胞沉降率（ESR）、類風濕因子（RF）、免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）；⑤白細胞介素（IL）-21檢測：收集患者空腹血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-21水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行；⑥Tfh、Tfr細胞檢測：用EDTA-K2抗凝管收集患者清晨空腹新鮮血樣。全血紅細胞裂解液離心至細胞變成白色，細胞懸液里加入CD4、CD3、趨化因子受體5

（CXCR5）抗體（CD185），37 ℃避光孵育30 min，然后加入500 μL固定液，孵育30 min，離心去上清，加入500 μL破膜液，孵育30 min，離心去上清，加入100 μL PBS，再加入叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3（FoxP3），37 ℃避光孵育30 min，加入400 μL PBS后用流式細胞儀檢測細胞表型。CD3+CD4+CXCR5+FoxP3+的細胞定義為Tfr細胞，CD3+CD4+CXCR5+FoxP3-的細胞定義為Tfh細胞。⑦西醫(yī)評價量表：視覺模擬評分法（VAS）評分、健康評估問卷（HAQ）評分、28個關節(jié)病情活動指數(shù)（DAS28）評分、關節(jié)功能分級。⑧營衛(wèi)失調(diào)證候積分。

2.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0、Graph Pad Prism 9軟件進行統(tǒng)計學分析、作圖。計量資料符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布以表示；不符合正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示；符合正態(tài)分布的連續(xù)資料采用Pearson分析，等級資料采用Spearman分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 RA相關指標分布 RA患者ESR、hs-CRP、RF、抗CCP抗體、IgG、IgM、IgA、關節(jié)腫脹數(shù)、關節(jié)壓痛數(shù)、VAS評分、HAQ評分、DAS28評分、關節(jié)功能分級情況見表1。

3.2 營衛(wèi)失調(diào)證候積分、Tfh細胞比例、Tfr細胞比例、Tfh/Tfr細胞比值、IL-21分布 62例RA患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分（6.52±2.93）分，Tfh細胞比例7.03（3.54，15.21）%，Tfr細胞比例1.04（0.40，4.19）%，Tfh/Tfr細胞比值4.86（1.19，26.37），IL-21水平15.91（14.18，20.36）pg·mL-1。見圖1。

3.3 營衛(wèi)失調(diào)證候積分與RA指標的相關性 RA患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分與年齡、病程、ESR、IgA、關節(jié)壓痛數(shù)、HAQ評分、DAS28評分呈正相關（P < 0.05）。見表2。

3.4 營衛(wèi)失調(diào)證候積分與Tfh細胞比例、Tfr細胞比例、Tfh/Tfr細胞比值、IL-21的相關性 RA患者中，營衛(wèi)失調(diào)證候積分與Tfh/Tfr細胞比值、IL-21呈正相關（P < 0.05），營衛(wèi)失調(diào)證候積分與Tfr細胞比例呈負相關（P < 0.05）。見表3。

4 討 論

RA屬于自身免疫性疾病，遺傳與環(huán)境因素共同作用于免疫系統(tǒng)，導致T細胞信號傳遞異常，免疫功能受損，以致自身免疫反應發(fā)生［6］。RA的基礎病理為慢性滑膜炎。ZHOU等［7］證明，Tfh細胞是RA患者滑膜中的主要浸潤免疫細胞，與記憶激活的CD4+ T細胞、參與RA早期發(fā)病的生物標志物顆粒酶A（GZMA）和發(fā)揮促炎作用的M1巨噬細胞呈正相關，并猜測GZMA-Tfh細胞可能參與了RA的早期發(fā)病。RA疾病活動度也與Tfh細胞相關。研究表明，疾病活動期的RA患者外周Tfh細胞比例高于穩(wěn)定期RA患者與健康對照組，同時外周Tfh細胞比例也與抗CCP抗體、RF及DAS28評分呈正相關［8-9］。RA的發(fā)病也有Tfr細胞的參與，RA患者的Tfr細胞數(shù)量與IgG、RF、抗CCP抗體、DAS28評分呈負相關。隨著RA患者的病情穩(wěn)定緩解，循環(huán)Tfr細胞增加，抑制自身免疫，穩(wěn)定病情［10］。

《靈樞·營衛(wèi)生會篇》中記載營衛(wèi)來源于水谷精微，屬于人體的營養(yǎng)物質(zhì)，“其輕者為營，濁者為衛(wèi)”。營氣在脈中循行，可以“榮四末”“內(nèi)注五臟六腑”；衛(wèi)氣“行于四末、分肉、皮膚之間而不休”“熏于肓膜，散于胸腹”。營衛(wèi)同源異質(zhì)， 是抵御外邪的重要物質(zhì)。RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，以關節(jié)腫痛、晨僵為主要臨床表現(xiàn)，典型的發(fā)病部位包括手部關節(jié)、腕關節(jié)、膝關節(jié)以及足部關節(jié)，而關節(jié)附近的肌肉、軟組織也會受影響。RA的發(fā)病病位與營衛(wèi)的循行部位相合?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中明確提出營衛(wèi)不和是痹證發(fā)生的內(nèi)因。營衛(wèi)不和，正氣耗損，抵御外邪無能，與“風寒濕氣合”，痹阻關節(jié)、肌肉與經(jīng)絡，形成痹證。營衛(wèi)失于調(diào)和是痹證從組織改變到病理損害的內(nèi)在機理［11］。馬運鋒等［12］認為，營衛(wèi)失和是RA整個發(fā)病過程中的內(nèi)在依據(jù)，但早期外因為風寒濕熱，內(nèi)因是營衛(wèi)不和；中期外因為風寒濕熱深伏，內(nèi)因是營虛衛(wèi)弱、臟腑功能失調(diào)；晚期外因是風寒濕熱與痰瘀膠結(jié)，內(nèi)因為營衛(wèi)俱微、臟腑虛損。本研究中，RA患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分與年齡、病程、ESR、IgA、關節(jié)壓痛數(shù)、HAQ評分、DAS28呈正相關（P < 0.05），證明營衛(wèi)失和是RA發(fā)生、發(fā)展的基本病機，貫穿RA發(fā)病的整個過程，影響患者病情。

從西醫(yī)學的角度來看，營血可對應血液循環(huán)系統(tǒng)，衛(wèi)氣或相當于免疫系統(tǒng)，營衛(wèi)循行可與免疫細胞在淋巴管、血管、組織間隙再到淋巴管的循環(huán)對應［11］。已有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)和營衛(wèi)具有調(diào)節(jié)免疫的作用，調(diào)節(jié)營衛(wèi)的代表方劑——桂枝湯、桂枝芍藥知母湯可以影響CD4+ T細胞水平［13-15］。Tfh細胞與Tfr細胞影響彼此分化、共同發(fā)揮免疫作用與衛(wèi)陽營陰的對立制約、互根互用相似，且都在RA發(fā)生、發(fā)展中表現(xiàn)為失衡則致病。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，RA患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分與Tfh/Tfr細胞比值呈正相關（P < 0.05），與Tfr細胞比例呈負相關（P < 0.05），說明從中西醫(yī)結(jié)合角度看待RA發(fā)病機制，營衛(wèi)失調(diào)可與Tfh/Tfr細胞失衡對應，Tfh/Tfr細胞平衡可能屬于營衛(wèi)和調(diào)在現(xiàn)代理論下的具象體現(xiàn)。白芍總苷屬于免疫調(diào)節(jié)藥，是白芍的有效成分，可用于RA治療。研究表明，白芍總苷可通過STAT3信號通路抑制Tfh細胞分化和GC形成［16］，還可以調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg細胞亞群平衡［17］。桂枝、白芍是調(diào)節(jié)營衛(wèi)的經(jīng)典藥對，結(jié)合上述研究，提示調(diào)節(jié)營衛(wèi)可能就是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。但目前尚未發(fā)現(xiàn)桂枝提取物對Tfh或Tfr細胞有影響以及白芍提取物是否可作用于Tfr細胞分化，還需要進一步的研究驗證這一經(jīng)典藥對對免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的影響。

本研究還觀察到RA患者營衛(wèi)失調(diào)證候積分與IL-21呈正相關（P < 0.05）。Tfh細胞產(chǎn)生IL-21，IL-21也可以自分泌方式促進Tfh細胞分化并誘導其自身表達［18］。IL-21還可以調(diào)節(jié)Tfh/Tfr平衡，對T、B細胞分化，抗體生成有著重大意義［19］。本研究已經(jīng)得出Tfh/Tfr細胞比例與營衛(wèi)失調(diào)證候積分相關，而IL-21與Tfh/Tfr穩(wěn)態(tài)相關，故營衛(wèi)失調(diào)證候積分與IL-21正相關符合預期結(jié)果。

本研究收集的樣本量有限，所納入的RA患者存在地域局限性，大部分患者處于疾病活動期，可能存在選擇偏倚，擬下一步聯(lián)合其他醫(yī)院開展多中心研究，為中醫(yī)學診療RA提供思路和依據(jù)，亦為RA的中西醫(yī)發(fā)病機制研究提供支持。另外，本研究初步觀察RA患者營衛(wèi)失調(diào)與Tfh/Tfr細胞失衡的相關性，未設計健康對照組，存在年齡、性別、合并病等混雜因素，限制了結(jié)果的推廣，下一步擬加入健康對照組驗證營衛(wèi)與Tfh/Tfr細胞之間的關系。此外，本研究證實RA患者營衛(wèi)失調(diào)與Tfh/Tfr細胞失衡相關，營衛(wèi)失調(diào)是RA發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在依據(jù)。在此過程中，本研究未細分營衛(wèi)失調(diào)是營衛(wèi)不暢還是營衛(wèi)有余還是營虛衛(wèi)弱，下一步可基于本試驗的結(jié)果，探尋不同RA患者營衛(wèi)狀態(tài)以及Tfh/Tfr細胞失衡與不同營衛(wèi)狀態(tài)的相關性，促進中醫(yī)的免疫學研究，為中醫(yī)的治法治則提供更多的思考角度。

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收稿日期：2024-01-24；修回日期：2024-03-08