【摘 要】目的：采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法研究苗藥見血飛干預類風濕關節(jié)炎作用機制，為基礎研究及臨床研究提供依據(jù)。方法：文獻檢索篩選見血飛的活性成分，通過Swiss ADME網(wǎng)站預測藥物靶點，利用Genecards數(shù)據(jù)庫、DisGeNet數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、MalaCard數(shù)據(jù)庫及TTD數(shù)據(jù)庫篩選類風濕關節(jié)炎相關靶點；采用CytoScape 3.8.2軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡及活性成分-關鍵靶點-通路；使用R語言進行GO富集分析和KEGG通路富集分析；使用Molecular Operating Environment（MOE）進行分子對接。結(jié)果：預測TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9是見血飛干預類風濕關節(jié)炎的關鍵靶點；分子對接表明Decarine、飛龍掌血素、白屈菜紅堿、二氫白屈菜紅堿、珊瑚菜內(nèi)酯、橙皮素、Oxychelerythrine和茵芋堿與TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9對接結(jié)合力平均值-5.92 kcal·mol-1。

結(jié)論：通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法，初步揭示了見血飛干預類風濕關節(jié)炎的潛在機制。關鍵靶點包括TLR4、CASP3、PTGS2和MMP-9，進一步實驗驗證有望為見血飛的臨床應用提供理論支持。

【關鍵詞】 類風濕關節(jié)炎；見血飛；網(wǎng)絡藥理學；分子對接

Exploring the Mechanism of Jianxuefei in Treating Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method

ZHANG Yu-qing，YANG Bing，HUANG Xin-fu，MA Wu-kai，YANG Peng

【ABSTRACT】Objective：To investigate the mechanism of Miao medicine Jianxuefei（Root of Spinyleaf Pricklyash）in the intervention of rheumatoid arthritis（RA）using network pharmacology and molecular docking method，and provide a basis for basic and clinical research.Methods：Literature search was conducted to screen the active ingredients in Jianxuefei.Drug targets were predicted through the website Swiss ADME，and RA related targets were screened using databases Genecards，DisGeNet，DRUGBANK，OMIM，MalaCard，and TTD.Protein interaction network and active ingredient key target pathway was constructed using software CytoScape 3.8.2.GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed using R language.Molecular Operating Environment（MOE）was used for molecular docking.Results：TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9 were predicted to be key targets for the intervention of RA in the blood.Molecular docking showed that the average binding affinity of Decarine，Phellinin，Chelerythrine，DihydroChelerythrine，Coranolactone，Hesperetin，Oxychelerythrine，and Coloane to TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9 was

-5.92 kcal·mol-1.Conclusion：Through network pharmacology and molecular docking method，the potential mechanism of Jianxuefei’s intervention in RA has been preliminarily revealed.The key targets include TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9，and further experimental validation is expected to provide theoretical support for the clinical application of Jianxuefei.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;Jianxuefei;network pharmacology;molecular docking

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種

以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病［1］。其發(fā)病機制不明，但與遺傳、免疫紊亂、環(huán)境等因素密切相關。治療以非甾體抗炎藥（NSAIDs）、改善病情抗風濕藥（DMARDs）、生物制劑、糖皮質(zhì)激素為主，但不良反應大，易引起肝腎損傷、潰瘍、感染、心血管疾病等損害［2］。

苗藥見血飛，又稱飛龍掌血［Toddalia asiatica （L.）Lam.］，是蕓香科、飛龍掌血屬植物［3］，提取物具有抗關節(jié)炎、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種作用［4］。然而見血飛治療RA的機制尚不清楚。已有研究表明，飛龍掌血的根皮提取物在多種體外和體內(nèi)模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，并能通過多變量統(tǒng)計分析確定其藥效物質(zhì)基礎［5］。另有研究表明，見血飛不僅在抗炎和抗腫瘤方面有顯著效果，還具有止血和保肝作用，其機制已通過多種實驗研究驗證［6］。這些研究為本課題提供了科學依據(jù)。

網(wǎng)絡藥理學基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡，通過網(wǎng)絡分析，系統(tǒng)綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡的干預與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘［7］。分子對接是通過化學計量學方法模擬分子的幾何匹配和能量匹配，對于給定的蛋白質(zhì)和配體（蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子），可以預測它們的結(jié)合模式及結(jié)合自由能，進而對其功能及作用機制進行研究［8-9］。

為了更好地分析苗藥見血飛干預RA的作用機制，本研究借助網(wǎng)絡藥理學及分子對接，預測苗藥見血飛的有效活性成分及其潛在作用靶點，為深入研究藥效物質(zhì)基礎、作用機制以及臨床應用提供一定的基礎。

1 資料與方法

1.1 活性成分的篩選和靶點預測 通過查閱飛龍掌血化學成分信息文獻查找化合物，將所得化合物結(jié)構(gòu)圖輸入Swiss ADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）進行預測，以“homo sapiens”為選擇物種，設置潛在核心化合物的標準為：①腸胃吸收（gatrointestinal absortion；GIabsortion）為“High”，表明成分具備良好口服生物利用度，可被吸收；②設置5類藥性預測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge），結(jié)果中有2個及2個以上為“Yes”［10-11］。獲取潛在化合物的靶點，選擇“Probability≥0.1”的靶點。

1.2 RA相關靶點篩選 以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞搜索DisGeNet數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、MalaCard數(shù)據(jù)庫以及TTD數(shù)據(jù)庫，獲得RA核心基因靶點。其中DisGeNet數(shù)據(jù)庫獲取的基因靶點，選擇“Score_gda≥0.1”的靶點，而GeneCards數(shù)據(jù)庫選擇“Relevance score（相關系數(shù)）≥0.1”的靶點基因。合并上述數(shù)據(jù)庫獲得的RA相關疾病靶點并刪除重復值。

1.3 活性成分靶點與疾病靶點的篩選 RA疾病基因靶點與藥物相關靶點進行整合，導入R軟件輸入藥物靶點、疾病靶點，兩者取交集后獲得“活性成分-疾病共同靶點”，并制作韋恩圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建和核心靶點的篩選 將“藥物-疾病共同靶點”導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），以“homo sapiens”為選擇物種，最小互作閾值設定為“highest confidence（最高置信度） > 0.9”，其余為默認設置，以獲得PPI網(wǎng)絡關系，并通過Cyto Scape 3.8.2軟件制作PPI網(wǎng)絡圖，使用“Analysis Network”工具得到PPI網(wǎng)絡之間的相關參數(shù)?；凇癉egree（度值）”“Betweennesss centrality（間性中心性）”“Closenessss centrality（親和中心性）”對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)判斷RA核心靶點。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析 將“藥物-疾病共同靶點”導入R語言，使用ClsuterProfiler程序包，得出GO富集分析和KEGG富集通路分析。其中GO富集分析中包含生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）3個模塊。

1.6 “活性成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建 將“藥物-疾病共同靶點”與見血飛潛在活性成分、關鍵靶點和KGEE富集通路導入Cytoscape 3.8.2軟件，繪制“活性成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡。

1.7 分子對接驗證 將篩選出的“潛在活性成分”與“核心靶點”進行分子對接驗證?！昂诵陌悬c”通過RCSB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/pdb）下載靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)，使用MOE 2019軟件去除水分子及自帶配體，使用QuickPrep對蛋白進行加氫、質(zhì)子化等?！昂诵某煞帧睆腜ubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.nc-bi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，使用MOE 2019進行能量最小化。最后進行分子對接，并計算對接結(jié)果的結(jié)合能。

2 結(jié) 果

2.1 見血飛成分篩選及靶點 通過文獻［12-17］獲取參與實驗研究的藥物成分，合并剔除重復成分后得到13個藥物成分，經(jīng)SwissADME平臺篩選出符合要求的8個活性成分，其中包括Decarine、飛龍掌血素、白屈菜紅堿、二氫白屈菜紅堿、茵芋堿等，見表1。同時Swiss-Target Prediction平臺預測，選取符合要求的靶點后去重得到365個靶點。

2.2 RA相關靶點 在Genecards數(shù)據(jù)庫中得到RA相關作用靶點4956個，選擇相關度得分≥10的靶點作為RA的潛在靶點，獲得361個相關靶點。結(jié)合DisGeNet數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、MalaCard數(shù)據(jù)庫及TTD數(shù)據(jù)庫，去重后合并，最終得到555個RA潛在靶點。將“2.1”項篩選出的365個靶點與555個RA潛在靶點，導入EVenn網(wǎng)站，得到73個共同靶點，即“藥物-疾病共同靶點”，并通過EVenn網(wǎng)站繪制韋恩圖，見圖１。

2.3 PPI網(wǎng)絡 將“2.2”項得出的“藥物-疾病共同靶點”的73個靶點，通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡后導入CytoScape 3.8.2軟件進行可視化處理，見圖2。其中節(jié)點表示靶基因，邊表示靶基因間的相互作用關系。該網(wǎng)絡中涉及72個節(jié)點，936條邊。使用CytoScape 3.8.2軟件中的“Analysis Network”工具得出度值、間性中心性、親和中心性排前4的核心基因，見表2，分別為TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9，提示作為核心基因在治療RA過程中發(fā)揮重要作用。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 將“2.2”項得出的“藥物-疾病共同靶點”73個靶點，導入R語言進行見血飛藥物成分干預RA靶點的GO富集分析（見圖３）和KEGG通路富集分析（見圖4），可見主要涉及生物學過程的有：對細胞因子產(chǎn)生的積極調(diào)節(jié)、對類固醇激素的反應、膠原蛋白分解過程等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，其中主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號傳導通路、卡波西肉瘤相關的通路等。

2.5 活性成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡 活性成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡圖中共有101個節(jié)點，其中見血飛8個藥物成分，“藥物-疾病共同靶點”中的73個靶點與KEGG富集出的20個通路，三者導入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“活性成分-關鍵靶點-通路”網(wǎng)絡，見圖5。結(jié)果顯示，見血飛的8個藥物成分可調(diào)控多個關鍵靶蛋白，作用于多條通路發(fā)揮干預RA的作用。

2.6 分子對接 將“2.2”項得出的8種核心潛在化合物，即Decarine、飛龍掌血素、白屈菜紅堿等，與“2.4”項得出4個核心靶點TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9分別進行分子對接。當Affinity < 0 kcal·mol-1時，認為分子蛋白質(zhì)自發(fā)結(jié)合并相互作用，而且結(jié)合能越低，分子構(gòu)象越穩(wěn)定，Affinity < -5 kcal·mol-1，表明對接結(jié)合力較好［18］。

其中對接最高Affinity值為PYGS2-飛龍掌血素，值為-7.26 kcal·mol-1，而最低Affinity值為MMP-9-茵芋堿值，值為-4.69 kcal·mol-1，對接結(jié)合力平均值為-5.92 kcal·mol-1，提示整體對接結(jié)合力較好，見圖6。其中部分核心靶點與藥物成分部分分子對接可視化結(jié)果，見圖7。

3 討 論

本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，預測苗藥見血飛治療RA潛在核心成分及核心靶點，從“活性成分-關鍵靶點-通路”將8種藥物成分作為潛在核心成分。其中飛龍掌血素在脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW264細胞模型中抑制的p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2的磷酸化和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的激活，并且能夠抑制炎癥因子mRNA的表達和一氧化氮的產(chǎn)生［19］，同時飛龍掌血素在250 μmol·L-1可誘導U-937細胞的凋亡，涉及ERK和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平下降［20］。白屈菜紅堿在飛龍掌血根的乙酸乙酯部位中含量最高，且白屈菜紅堿具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗纖維化等作用，其中白屈菜紅堿抗腫瘤作用涉及抑制蛋白激酶C（PKC）的活性、促凋亡的信號通路等［14］。二氫白屈菜紅堿及Decarine對人肺癌細胞H1299-EGFP的生長有顯著的抑制作用［16］。飛龍掌血醇提物可降低佐劑性關節(jié)炎大鼠血清和關節(jié)滑膜組織中白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2含量，并且提示重建促炎和抗炎細胞因子的平衡，可能是其治療RA的機制之一［21］。盡管本研究主要依賴于網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法，缺乏實驗驗證，但通過文獻綜述和已有研究的支持，見血飛在抗炎和抗腫瘤方面的潛力得到了初步確認。未來的研究應注重實驗驗證，以進一步鞏固和擴展這些發(fā)現(xiàn)，特別是在細胞實驗和動物模型中檢驗見血飛的實際療效和作用機制。此外，臨床研究也應被納入考量，以確定見血飛在RA患者中的實際應用效果和安全性。

KEGG富集通路提示PI3K-AKT信號通路，而PI3K-AKT信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，此通路與RA成纖維樣滑膜細胞（FLS）凋亡異常密切相關，抑制異?；罨腜I3K-AKT信號通路可以誘導RA-FLS凋亡，對RA有治療作用［22］。以見血飛為組成的苗藥“四大血”對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜血管增生研究提示，四大血可抑制AKT的磷酸化水平，并且緩解滑膜血管新生和炎癥，從而發(fā)揮治療作用［23］。進一步預測見血飛調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路干預RA。

在PPI網(wǎng)絡中，排名前4的核心基因為TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9。TLR4與RA滑膜炎癥聯(lián)系最為密切，可誘導NF-κB活化，進而上調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達，促進免疫炎癥反應［24］，并且NF-κB通路參與免疫細胞的轉(zhuǎn)移以及骨吸收，與RA的病理發(fā)展進程密切相關［25］。

CASP3是細胞凋亡的關鍵參與者，細胞凋亡過程中CASP3轉(zhuǎn)化為活化形式的半C-CASP3才能執(zhí)行細胞最終凋亡程序。有研究提示，飛龍掌血醇提物組對人非小細胞肺癌細胞系A549細胞中C-CASP3的蛋白表達量增加［26］。PTGS2又名環(huán)氧化酶2（COX-2），其催化花生四烯酸生成前列腺素，從而加劇炎癥反應和組織損傷。COX-2抑制劑，如塞來昔布，已被廣泛應用于臨床，以緩解RA引起的關節(jié)腫痛。MMP-9又稱明膠酶B，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，在軟骨降解以及骨破壞中發(fā)揮重要作用，可釋放生物活性形式的血管內(nèi)皮生長因子，并對血管基底膜蛋白有直接的蛋白水解作用［27］。并且有研究提示，RA合并間質(zhì)性肺病中MMP-9與病情嚴重程度密切相關［28］，檢測其水平有助于臨床診治，同時可以用于判斷預后。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析苗藥見血飛治療RA的作用機制，預測見血飛治療RA的有效成分及其關鍵靶點、作用通路，體現(xiàn)了多成分、多靶點、多通路的作用特點，同時以分子對接對核心成分與核心靶點進行檢驗，其結(jié)果平均分為-5.92 kcal·mol-1，提示兩者對接結(jié)合力較好，更一步為見血飛治療RA的深入研究提供參考依據(jù)。

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收稿日期：2024-04-06；修回日期：2024-05-20