黃飛 祁業(yè)輝 劉桂芹 王長法 周苗苗

摘 要 旨在克隆驢硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase-1， SCD1）基因并進行生物信息學(xué)分析、檢測其在驢不同組織中的表達。設(shè)計 SCD1基因引物，PCR克隆得到其CDS序列，然后對 SCD1基因編碼產(chǎn)物進行生物信息學(xué)預(yù)測，同時使用qRT- PCR檢測驢心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪、乳腺內(nèi) SCD1基因mRNA相對表達量。結(jié)果顯示，驢 SCD1基因CDS長1 080 bp，可編碼359個氨基酸，SCD1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為41.61 ku，等電點為9.32，不穩(wěn)定指數(shù)為44.16，疏水性總平均值為-0.157，屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白；SCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（51.25%）和無規(guī)則卷曲（42.62%）構(gòu)成。 SCD1基因在所檢測驢組織中均有表達，其中在肝臟中表達量最高，脂肪、乳腺和肺臟中次之，心臟和肌肉中最低（P<0.05），提示 SCD1在驢肝臟、脂肪和乳腺等組織不飽和脂肪酸的合成過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞? SCD1 ；驢；基因克隆；生物信息學(xué)分析；組織表達

硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）是催化單不飽和脂肪酸合成的限速酶，參與細胞的新陳代謝和前體脂肪細胞的分化，廣泛存在于動物各種組織細胞中。SCD1可將細胞中的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)椴伙柡椭舅?，在動物體內(nèi)脂肪合成和代謝調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的生理作用［1］。Rincon等［2］研究發(fā)現(xiàn)SCD基因的表達及其產(chǎn)物的活性決定了脂肪細胞單不飽和脂肪酸的合成及細胞膜磷脂和甘油三酯的組成， SCD1基因可通過膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）通路來調(diào)控乳脂的合成。另有研究發(fā)現(xiàn)SCD1可以介導(dǎo)還原型輔酶Ⅰ（NADH）-泛素氧化還原酶亞基A9（Ndufb9）通路對脂肪合成的調(diào)控，用阿氨酚抑制SCD1活性可抑制Ndufb9通路，進而阻斷脂肪的合成［3］。此外，SCD1亦可介導(dǎo)Ndufa6對成脂分化的調(diào)控作用［4］。

SCD1蛋白由大約359個氨基酸殘基組成，有4個跨膜區(qū)，種間高度保守，參與脂肪的代謝調(diào)節(jié)［5］。周秀敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，牛 SCD1基因可編碼359個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其平均分子質(zhì)量為41.71 ku，是一種不穩(wěn)定的水溶性蛋白。石恒波等［7］研究發(fā)現(xiàn)山羊SCD基因CDS序列全長為1 080 bp，進一步研究發(fā)現(xiàn)乳腺中SCD可通過調(diào)控脂肪酸合成酶（FASN）、心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）、瘦素受體蛋白（LEPR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）等基因的表達影響乳脂中脂肪酸的組成。Zhang等［8］研究發(fā)現(xiàn)，牛血管基質(zhì)組分（SVF）細胞中過表達? SCD1可增強PPARγ受體活性，進而增加脂滴積累（12?? μg/mg）。Burchat等［9］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道SCD1不僅可以調(diào)節(jié)腸道組織脂質(zhì)含量，亦可調(diào)節(jié)血漿和肝臟的脂質(zhì)代謝。Jin等［10］對山羊基因的研究表明， SCD1基因?qū)ι窖蛑舅岽x有重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)驢脂肪和乳脂具有不飽和脂肪酸高的特點［11-12］，研究SCD1在驢不飽和脂肪酸合成過程中的調(diào)控作用具有重要意義。然而，目前關(guān)于驢 SCD1基因的研究鮮見報道。因此，本試驗研究驢 SCD1基因的克隆及組織表達規(guī)律，為進一步研究SCD1調(diào)控驢脂肪和乳脂中不飽和脂肪酸的合成以及改善驢奶和驢肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 驢組織樣品來自于山東東阿天龍食品有限公司。選取4頭健康的德州母驢，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、乳腺和皮下脂肪，液氮速凍，-80 ℃冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 pGM-T Fast克隆試劑盒、? E. coli DH5α感受態(tài)細胞、DNA凝膠回收試劑盒均購于天根生化有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M5 Super qPCR RT kit with Gdna remover）和熒光定量試劑盒（2×Real- time PCR Super mix SYBRgreen，with anti-Taq）均購于北京聚合美有限公司 ；2×Es Taq Master- Mix（Dye）購自康為世紀公司；DNA Marker購自中科瑞泰有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與全長cDNA克隆 Trizol法提取驢肝臟總RNA。Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用高保真酶以 SCD1基因的cDNA為模板進行PCR擴增：引物見表1；反應(yīng)體系總體積為50 μL，5×buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L） 4 μL、上游引物（10 μmol/L） 1.5 μL、下游引物（10 μmol/L） 1.5 μL、酶（2.5 U/μL） 0.5 μL、模板 2.0 μL、雙蒸水? 30.5 μL；反應(yīng)條件為98 ℃ 10 s→? 55 ℃?? 5 s→? 72 ℃ 1.75 min（擴增35個循環(huán)）→? 72 ℃?? 5 min。PCR產(chǎn)物在電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Magen）回收并純化目的產(chǎn)物。膠回收產(chǎn)物連接克隆載體pTOPO - Blunt vector（Azbio - chem）轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含100?? μg/mL氨芐青霉素LB（Luria - Bertani）的平板于37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取陽性菌落PCR鑒定，并交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 SCD1生物信息學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 通過ORF Finder推導(dǎo)氨基酸序列；利用計算機pI/Mw工具（ExPASy Proteomics Server）、NetNglyc、NetPhos等在線預(yù)測SCD1蛋白的分子質(zhì)量、理論等電點、二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)等（表2）；利用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［13］。

1.2.3?? SCD1基因組織表達分析（qRT-PCR） Trizol法分別提取各組織的總RNA。取1 mg RNA，用Prime Script○RRT試劑盒（TaKaRa）合成cDNA。然后用SYBR○RTrimeScriptTM試劑盒（TaKaRa）在ABI 7500（Applied Biosystems，Singapore）上測定 SCD1基因相對表達量。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL。PCR引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH）為內(nèi)參，采用2-△△Ct的方法計算 SCD1基因相對表達量［14-15］。每個樣品重復(fù)３次，超純水替代樣品做陰性對照。

1.2.4 統(tǒng)計與分析 所有數(shù)據(jù)用SAS 9.2進行分析，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用柱狀圖表示，誤差線為標準差。當P<0.05時認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1?? SCD1的基因提取及克隆

Trizol法提取驢肝臟組織總RNA（圖1-a）。將RNA反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板，PCR特異性擴增 SCD1基因。PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測發(fā)現(xiàn)一條約1 000 bp大小的條帶（圖1-b）。重組后菌液PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1-c，電泳條帶大小約為1 000 bp，與目的基因大小一致。

2.2? SCD1的基因序列及系統(tǒng)進化樹分析

經(jīng)測序驗證成功擴增 SCD1基因。序列比對分析表明 SCD1的開放閱讀框為1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基組成的多肽鏈（圖2）。根據(jù)不同動物 SCD1基因的序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示，驢和平原斑馬、馬的 SCD1基因相似度最高， 親緣關(guān)系最近。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 SCD1蛋白理化性質(zhì)及親/疏水性表達分析 利用ProtParam軟件對SCD1蛋白進行預(yù)測得出其分子式為C1937H2919N501O506S9；分子質(zhì)量為41.61 ku；脂肪族指數(shù)為88.86；帶負電荷殘基總數(shù)（色氨酸、谷氨酸）為32個；帶正電荷殘基（精氨酸、賴氨酸）總數(shù)為43個；等電點為9.32，屬于堿性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)44.16，基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)大于40 ［16］，屬于不穩(wěn)定蛋白。氨基酸組成分析結(jié)果顯示，SCD1蛋白含有20種氨基酸，其中占比最高的是亮氨酸（Leu），占11.7%；其次是丙氨酸（Ala），占7.8%；最低的是半胱氨酸（Cys），僅占0.8%。

利用ProScale分析驢SCD1親/疏水性，發(fā)現(xiàn)225處Leu存在最大疏水值3.2；在64處組氨酸（His）存在最小疏水值-3.0；疏水性平均值為?? -0.157，屬于親水性蛋白（圖4）。

2.3.2 SCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)及二硫鍵預(yù)測 通過NovoPro在線工具預(yù)測SCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)中有184個α-螺旋（Hh）、22個β-折疊（Ee）和153個無規(guī)則卷曲（Cc），占比分別為51.25%、6.13%和42.62%（圖5）。利用SCRATCH Protein Predictor在線工具預(yù)測，SCD1蛋白存在兩個Cys和一個二硫鍵。二硫鍵的位置可能在蛋白質(zhì)的226和326個氨基酸殘基之間，可推出兩個Cys也分別位于肽鏈的226和326位置。

2.3.3 SCD1蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 運用SignalIP-5.0分析SCD1信號肽，發(fā)現(xiàn)SCD1中信號肽存在的可能為0.095%；利用TMHMM 2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SCD1有4個跨膜區(qū)。

2.3.4 SCD1蛋白修飾位點預(yù)測 通過NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1預(yù)測驢SCD1蛋白糖基化修飾位點和磷酸化位點。發(fā)現(xiàn)在第259和318位氨基酸處存在N-糖基化位點；預(yù)測SCD1蛋白磷酸化位點結(jié)果顯示SCD1蛋白有10個絲氨酸（Ser）、9個蘇氨酸（Thr）和5個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，共24個。

2.3.5? SCD1基因組織表達分析 通過qRT-PCR技術(shù)檢測驢8個組織中 SCD1基因的mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)在所有組織中都檢測到 SCD1基因，表達量從高到底依次為肝臟、脂肪、乳腺、肺臟、腎臟、脾臟、肌肉和心臟（P<0.05，圖6）。

3 討 論

SCD1是單不飽和脂肪酸生成過程中的關(guān)鍵酶［17-18］。已有研究表明，SCD1在癌細胞、脂肪組織以及乳腺組織脂肪酸代謝中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Mason等［11］研究發(fā)現(xiàn)，多種癌癥細胞的生存依賴于單不飽和脂肪酸的合成，SCD1等的缺失會引起不可逆的細胞毒性，并最終導(dǎo)致癌細胞死亡。另有研究表明，人體游離脂肪酸水平與其SCD1的表達量相關(guān)［12］。Duchemin等［19］研究發(fā)現(xiàn)奶牛 SCD1基因型可影響乳中不飽和脂肪酸含量。王小龍等［20］研究則發(fā)現(xiàn) SCD1基因型可影響奶牛乳蛋白率、乳脂率。Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)水牛乳腺中SCD1可通過調(diào)控脂代謝主控轉(zhuǎn)錄因子（ SREBP1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、磷酸甘油脂酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT）和?；视?磷酸?；D(zhuǎn)移酶（AGPAT）等基因表達來調(diào)控乳腺脂肪代謝。此外，Zou等［22］研究發(fā)現(xiàn)，SCD1可介導(dǎo)冷刺激引起的三酰甘油的分解，SCD1主要通過促進C3H10T1/2白色脂肪細胞的脂解來產(chǎn)生熱量供機體保暖。

目前，關(guān)于其他家養(yǎng)動物脂肪代謝的研究較多，而驢脂肪代謝調(diào)節(jié)相關(guān)研究較少［23-24］。驢肉和驢奶有不飽和脂肪酸含量高的特點［25-26］，研究SCD1在驢脂肪代謝中的作用，可為進一步改善肉質(zhì)、進行乳成分的合成調(diào)控提供基礎(chǔ)［1］。本研究結(jié)果表明，驢 SCD1基因CDS長1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基構(gòu)成的不穩(wěn)定的親水蛋白；驢SCD1蛋白氨基酸殘基的數(shù)目與牛［6］、羊［7］和豬［27］相同；驢SCD1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，與牛［6］、豬［27］ SCD蛋白相同，為不穩(wěn)定蛋白；據(jù)驢SCD1蛋白二級結(jié)構(gòu)推測，其三級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，含有少量的β-片層結(jié)構(gòu)，而牛SCD1蛋白完全不含β-片層結(jié)構(gòu)［6］。此外，驢 SCD1基因組織表達研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有檢測組織中均有SCD1的表達，其中肝臟中表達量最高，其次為脂肪、乳腺和肺臟，心臟和肌肉表達最低。以上結(jié)果提示 SCD1在驢肝臟、脂肪和乳腺等組織中發(fā)揮重要作用，為進一步研究驢脂肪和乳脂中不飽和脂肪酸的合成調(diào)控提供理論? 依據(jù)。

4 結(jié) 論

成功擴增出驢 SCD1基因，序列分析表明 SCD1基因的開放閱讀框為1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基組成的多肽鏈。

研究證實 SCD1基因在驢組織中普遍表達，且在肝臟、脂肪、乳腺和肺臟中高表達。

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Cloning and Tissue Expression of? SCD1?? Gene in Donkey

HUANG Fei，QI Yehui，LIU Guiqin，WANG Changfa and ZHOU Miaomiao

（Liaocheng Research Institute of Donkey High-Efficiency Breeding and Ecological Feeding， College of Agriculture of Liaocheng? University，Liaocheng Shandong 252000，China）

Abstract In this study，the full-length cDNA cloning，bioinformatics analysis and tissues expression of donkey stearoyl-CoA desaturase-1 （SCD1） gene was carried out. The CDS sequence of donkey? SCD1 gene was obtained by the PCR method first，and then the? bioinformatic prediction of the? SCD1 genes coding product was done. Additionally，the relative mRNA expression of the? SCD1 gene in different tissues of donkey （heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle，fat，and mammary gland） was determined by qRT-PCR. The results showed that the donkey? SCD1 genes CDS was 1 080 bp，which could encode a peptide with 359 amino acid residues; the molecular mass，isoelectric point，instability index，and hydrophobicity average value of SCD1 protein were 41.61，9.32，44.16，and -0.157，respectively，which was a basic hydrophilic protein with an unstable secondary structure. The secondary structure of SCD1 protein was mainly composed of α-helix （51.25%） and random coil （42.62%）. The mRNA of? SCD1 gene were expressed in all tested donkey tissues，and the relative mRNA level was highest in liver，followed by fat，mammary gland and lung，and lowest in heart and muscle （P

Key words? SCD1 ; Donkey; Gene cloning; Bioinformatics analysis; Tissue expression

Received? 2022-12-07??? Returned 2023-02-08

Foundation item National Key R&D Plan of China （No.2022YFD1600103）; Open Project for Animal Husbandry Research of Liaocheng University（No.319312101-09）;the Open Project of Liaocheng University Animal Husbandry Discipline（No.319462207-9）.

First author HUANG Fei，male，master student. Research area：herbivore lactation physiology.?? E-mail： 2470303187@qq.com

Corresponding?? author ZHOU Miaomiao，female，associate professor.Research area：herbivore lactation physiology. E-mail：zhoumm0329@163.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）